论文部分内容阅读
大豆疫霉菌是大豆疫霉根腐病的来源,它能够在全世界范围里破坏大豆的生长。它对大豆减产,危害很明显,是一种最具破坏性的疾病。大豆疫霉根腐病在我国病发的面积呈每年都扩大的趋势,严重的危害了我国大豆种植和生产。抗病品种的选择是最经济有效的措施,但由于大豆疫霉菌的致病力分化的复杂特性,生理变化快,容易导致丧失抗性,所以,相关抗性基因的挖掘,并且对基因进行研究,能为解决抗性基因工程问题的方法的理论基础。EIN3转录因子属于一个小的转录因子家族,在拟南芥、烟草、番茄和水稻中均有提高抗病性的报道。本课题组在使用高抗1号生理小种的大豆品种“绥农10”为实验材料建立的基因库中选择了两条EST序列。本研究利用RT-PCR技术从“绥农10”中分离出基因全长序列,是大豆中的新基因,命名为GmEON3-1、GmEIN3-2。通过对基因进行定量分析、亚细胞定位的观察、两个基因转入烟草和大豆、转基因植株离体的叶片进行抗病性鉴别等方法对两个基因进行了研究,研究成果如下：1.利用RT-PCR技术从“绥农10"中分离出GmEIN3-O基因全长序歹（GenBank accession no XM003519439.2）。EIN3-1基因的cDNA全序列为2486bp,ORF为1845bp,编码614个氨基酸,该基因在297核苷酸处有一个起始密码子ATG,2139处有一个终止密码子TGA。利用在线预测软件得出：EIN3-1编码的氨基酸中从168到305有一个保守的结构域,三级结构预测得出,在编码的氨基酸中有3个核定位信号。2.利用RT.PCR技术从”绥农10"中分离出GmEIN3-2基因全长序歹（GenBank accession no XM003545435.2）。EIN3-2基因的cDNA全序列为2576bp,ORF为1833bp,编码610个氨基酸,该基因在420核苷酸处有一个起始密码子ATG,2250处有一个终止密码子TGA。利用在线预测软件得出：EIN3-2编码的氨基酸中从168到305有一个保守的结构域,三级结构预测得出,在编码的氨基酸中有2个核定位信号。3.“绥农10”接种大豆疫霉菌,喷施乙烯、脱落酸和赤霉素,荧光定量PCR表明：EIN3-1、EIN3-2基因的表达受乙烯、疫霉菌、赤霉素和脱落酸诱导,其中受乙烯和疫霉菌诱导明显。4.构建了pCambIA1302-EIN3-2GFP融合表达的载体,利用基因枪法转入洋葱表皮可看出：EIN3-2基因编码蛋白定位在细胞核内。5.构筑了pCAMBIA3301-EIN3-1和pCAMBIA3301-EIN3-2的植物过表达载体,使用农杆菌介导的方法转化到烟草之中,经过PCR的鉴别,得出EIN3-1在T0代得到了转入基因的植株有6个,EIN3-2基因有11个。把阳性的植株的叶片切下来,在体外进行接种烟草疫霉菌,通过5天的试验可以看出来,转基因的烟草的叶片比非转基因的叶片抗病。6.本实验的外植体为感病的大豆品种“东农50”的子叶进行大豆的遗传和转化。获得转EIN3-1T2代阳性植株20株,转EIN3-2T3代阳性植株6株,Southern杂交表现阳性1株。用离体叶片接种大豆疫霉菌1号生理小种,结果显示转基因植株的抗病性比对照增强。