质体工程技术是一种具有很强应用前景的植物生物技术,不同于传统的植物细胞核转化体系,质体转化通过同源重组方式使外源基因整合到质体的基因组中。具有高效表达,多基因共转化,产物区域化,无基因漂移等优势。利用质体作为植物生物反应器表达重组蛋白可实现植物分子农场,通过质体代谢工程可生产高附加值代谢产物。但是,应用此技术仍然存在一些技术瓶颈,比如,目前能进行稳定质体转化的高等植物仅有6种,且均属于草本植物。主要原因在于较多的植物尚未建立良好的外植体再生条件,质体转化载体构建过程繁琐,缺乏合适的筛选方法等。杨树和猕猴桃是我国种植范围最广、经济重要性最强的木本植物之一,但均无成熟的质体转化体系。为了拓宽可稳定质体转化的植物种类,扩大该技术的应用范围,本研究以山杨树、猕猴桃为主要研究对象,利用质体转化技术对这两种植物进行质体转基因研究。得到的主要研究结果如下:1.我们采用在大肠杆菌体内克隆技术(i VEC)来快速组装质体转化载体。首先,通过一步法把组成质体转化载体的5个DNA片段无缝拼接,构建了烟草质体转化载体pYY12。该载体包括烟草质体基因组的左同源序列(trnf M-psa B段)和右同源序列(trn Gpsb Z段)、aad A表达盒、绿色荧光蛋白(GFP)表达盒、以及去除多克隆位点的质粒p Bluescript II SK(+)作为载体骨架。采用基因枪转化法将pYY12载体成功导入烟草质体基因组中,通过Southern杂交和种子测试分析验证了获得的质体转gfp基因烟草达到了同质化;激光共聚焦显微镜证实了GFP在质体转基因烟草中的存在位置;SDS-PAGE定量分析表明GFP在质体中高水平的积累量,达到总可溶性蛋白～9%。鉴于以上结果中的高GFP积累量,可以将pYY12载体中的表达元件(aad A表达盒和gfp表达盒)应用到其他植物的质体转化载体的构建。2.利用pYY12载体中的表达元件及山新杨基因组中的左右同源序列,我们构建了杨树质体转化载体pYY20(gfp)。利用山新杨叶片再生体系,我们成功地将pYY20导入杨树质体基因组中,通过2～3轮再生,获得了转化同质化的质体转化植株。同质化的Pa-YY20杨树植株中,GFP的积累量仅占总可溶性蛋白的0.005%。用苏云金芽孢杆菌(Bt)cry1C基因和cry3Bb基因分别替换杨树质体转化载体pYY20中的gfp基因,我们分别获得了pYY25(cry1C)和pYY26(cry3Bb)等两个质体转化载体。在得到的同质化Pa-YY25转基因山新杨植株中,发现Cry1C蛋白在不同组织中的积累量不同,在叶片中积累量最高达到20.74μg/g鲜重,其次是在成熟叶片和老叶片中,在非绿质体(韧皮部、木质部和根)中的含量极其微弱。Pa-YY25转基因山新杨对美国白蛾1-4龄幼虫3天的致死率均为100%,而Pa-YY26转基因山新杨对柳蓝叶甲1龄幼虫1天的致死率和成虫6天的致死率均为100%。获得了质体Bt基因工程产生抗虫杨树第一个成功实例,为今后杨树的遗传改良开辟了新的途径。3.构建了红阳猕猴桃质体转化载体pYY34,通过基因枪转化法成功获得了1株同质化的质体转gfp基因猕猴桃植株Ad-YY34,在其叶片中观察到了GFP的荧光信号,GFP在叶片中的积累量约占总可溶性蛋白的0.02%。本研究是猕猴桃质体中转基因的第一个成功案例,该质体表达系统的建立为高效生产可食用疫苗、药物和抗体提供了研究基础。综上所述,本研究成功的建立了一种基于i VEC法构建质体转化载体的方法;以及在木本植物山新杨、猕猴桃中的建立了质体转化体系,并获得了高效抗虫的质体转Bt山新杨植株,为植物的遗传改良提供了一条新的途径和方法。