研究背景青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis,AIS)是一种原因不明的三维脊柱畸形,主要发生于10至16岁的女孩中。AIS一般发病率在2-4%之间,致残率较高。如果AIS不及时治疗,不仅影响患者的体型、外观和心理,而且可能会发展成为严重的脊柱畸形,从而导致心肺功能受损、肢体瘫痪甚至死亡。目前AIS的治疗方法包括手术治疗和非手术治疗,大多都是通过生物力学的方式(存在很大风险)进行病情改善,并非基于因果关系从发病机制入手治疗。因此,阐明AIS的发病原因和致病机制,从而对有效预测和防治AIS具有重要的临床意义。同时,也为开发出更有针对性的治疗方法提供依据。越来越多的研究发现AIS患者存在骨密度降低的病理特点。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多向分化潜能,在特定诱导条件下可以向成骨细胞、软骨细胞分化。BMSCs是成骨的干细胞,在膜内成骨和软骨内成骨两种骨形成模式中是必不可少的。我们团队前期研究发现AIS患者BMSCs中基因、蛋白和非编码RNA表达异常,并且存在失调的增殖和发育信号通路。因此,我们提出假说:“BMSCs功能异常是AIS患者骨度密度降低的原因”。研究目的为了确定AIS患者BMSCs功能异常导致骨密度降低,我们首先从AIS患者和年龄性别匹配的健康供者骨髓标本中分离BMSCs,诱导后比较两者BMSCs体外成骨分化能力。论文的第二部分,前期AIS患者BMSCs的差异基因表达谱以及差异蛋白组学研究结果均提示MAPK信号通路失调,我们挑选出与MAPK信号通路相关且变化最显著的差异表达基因SPRY4进行研究。通过功能获得和缺失实验,系统地研究SPRY4对BMSCs体外成骨分化和体内异位骨生成能力的影响。此外,我们还探究了 SPRY4在褪黑素促进BMSCs成骨分化中的作用及具体分子机制。论文的第三部分,结合之前的microRNA芯片结果,我们围绕在AIS患者BMSCs中表达上调的miR-181b-5p展开研究。在扩大样本验证后,我们充分地研究其在BMSCs体外成骨分化和体内异位骨生成中的作用,并对其发挥功能的靶基因和分子通路进行探究。研究方法论文的第一部分,通过密度梯度离心法分离AIS患者和健康供者BMSCs。利用碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)染色、ALP活性检测、茜素红染色及定量分析的方法比较AIS患者与健康供者BMSCs成骨分化能力。论文的第二部分,对差异表达基因进行生物信息学分析挑选出SPRY4,并通过RT-qPCR方法扩大样本验证其在AIS患者中的表达变化。使用siRNA敲降和慢病毒过表达方法改变SPRY4表达,研究其在BMSCs体外成骨分化中的功能。建立小鼠体内异位骨生成模型,通过HE染色和Masson染色研究SPRY4改变对体内异位骨生成的影响。利用信号通路抑制剂和Western blot方法探索信号通路的变化。加入褪黑素及其他处理后进行成骨诱导,通过RT-qPCR和Western blot方法检测成骨分化关键转录因子及标志基因的表达,利用ALP染色等方法研究不同处理条件下BMSCs体外成骨分化能力的改变。论文的第三部分,分析micoRNA芯片的结果挑选出miR-181b-5p,通过RT-qPCR方法扩大样本验证miR-181b-5p在AIS患者中表达改变。转染miR-181b-5p模拟物或抑制剂研究其在BMSCs体外成骨分化中的功能。同样,通过异位骨形成模型、HE染色和Masson染色研究miR-181b-5p对体内异位骨生成的影响。通过生物信息学软件预测、双荧光素酶报告基因检测实验、Western blot方法以及siRNA敲降方法探究miR-181b-5p与靶基因SPRY4的结构与功能的匹配性。最后,利用Western blot方法验证miR-181b-5p对ERK磷酸化的影响。研究结果论文的第一部分,相比健康供者,AIS患者BMSCs成骨分化诱导后ALP染色阳性率、ALP活性以及茜素红染色阳性率降低,提示AIS患者BMSCs成骨分化能力下降。论文的第二部分,我们发现AIS患者BMSCs中SPRY4基因下调显著。敲降SPRY4抑制健康供者BMSCs体外成骨分化,过表达SPRY4促进AIS患者BMSCs体外成骨分化。SPRY4促进BMSCs体内异位骨的形成。机制研究发现SPRY4通过激活MEK-ERK1/2通路调节成骨分化。褪黑素可促进BMSCs成骨分化,但敲降SPRY4后褪黑素促进成骨分化作用消失。机制研究发现褪黑素处理上调SPRY4表达,SPRY4可通过MEK-ERK1/2信号通路介导褪黑素反应。因此,BMSCs中SPRY4的缺失导致成骨分化的减少,而这些缺陷在褪黑素的影响下进一步加剧。综上,SPRY4在调节成骨分化和褪黑素应答中起关键作用。论文的第三部分,我们发现AIS患者BMSCs中miR-181b-5p上调显著。过表达miR-181b-5p抑制健康供者BMSCs体外成骨分化,而抑制内源性miR-181b-5p促进AIS患者BMSCs体外成骨分化。此外,miR-181b-5p抑制BMSCs体内异位骨的形成。经生物信息学预测、双荧光素酶实验验证miR-181b-5p与SPRY4 mRNA的3’UTR特异性结合。过表达miR-181b-5p显著下调SPRY4蛋白的表达,但对SPRY4的mRNA无明显影响。敲降靶基因SPRY4阻断miR-181b-5p抑制剂促进成骨分化的作用。通路研究发现miR-181b-5p可能通过抑制ERK1/2的磷酸化参与BMSCs成骨分化。结论与来自健康供者的细胞相比,AIS患者BMSCs体外成骨分化能力下降。AIS患者BMSCs中SPRY4基因表达下调,通过抑制MEK-ERK1/2信号通路以及降低褪黑素反应削弱BMSCs成骨分化作用。AIS患者BMSCs中miR-181b-5p表达上调,通过下调SPRY4表达抑制ERK磷酸化从而削弱BMSCs成骨分化作用。上述研究提示,AIS患者BMSCs异常可通过调节成骨分化作用引起骨密度降低,可能参与AIS疾病发生。