两个水稻育性相关基因的精细定位

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水稻是我国重要的粮食作物之一,全国以稻米为主食的人口占到总人口的2/3,水稻的产量约占国内粮食作物总产量的1/3。三系杂交水稻的成功研制是当代世界农业发展史上的重大事件,它促进了水稻单产水平的大幅度提高,同时创造了显著的社会效益和经济效益。与三系杂交水稻相比较,两系杂交水稻的广泛应用有赖于以下几个方面:首先它极大地简化了生产程序,容易实现籼粳亚种间的杂种优势利用,其次它能够克服三系不育系的细胞质负效应,有利于自由灵活地选配新杂交组合。因此,挖掘利用新的两系不育系材料,定位和克隆新型光温敏雄性不育基因,并研究其作用的分子机理,将对培育优良的新型两系杂交水稻具有重要意义。本文主要由两部分构成,对两个水稻育性相关材料进行研究:第一部分,首先对一个稳定的雌雄不育突变体进行了表型观察,然后通过细胞学实验确定其败育时期,最后利用图位克隆结合Mutmap的方法成功克隆到该不育基因;第二部分,鉴定了一个温敏雄性不育突变体的表型,然后通过细胞学实验初步确定其败育时期,杂交实验证明其雌配子可育,分期播种实验证明其育性受光温条件的影响,利用实验室已有的分子标记对不育基因进行了精细定位。主要结果如下:(1)对一个水稻雌雄不育突变体进行表型观察。发现突变体表现完全不育,花药变白变细,I2-KI染色未观察到成熟花粉粒。通过醋酸洋红实验观察花粉发育情况,发现小孢子在单核期发生败育。花药半薄切片结果也显示,突变体的小孢子在单核期出现异常,且绒毡层提前降解,最终没有成熟花粉粒形成。对减数分裂时期孢原细胞的染色体进行DAPI染色,以观察染色体的分离情况,发现突变体中形成异常的单价体结构,最终导致染色体的不均等分裂。(2)以Fms2/fms2杂合子为母本,以籼稻品种‘N22’为父本构建F2分离群体。遗传分析结果表明,该不育性状受单隐性核基因控制。从F2群体中挑选极端个体和高育单株,对不育基因进行初连锁分析,发现在6号染色体分子标记RM162与RM5463之间存在连锁迹象,物理距离约为7.83Mb。利用F2群体的216个隐性极端个体对不育基因进行精细定位,将该基因定位在标记RM340和Hh-4之间,此区间的物理距离为448-kb。结合Mutmap方法分析的重测序结果,最终确定了一个候选基因。对该基因的基因组序列进行测序,发现在基因(LOC_Os06g47830)上存在一个单碱基的替换,此突变位于剪切识别位点处。(3)对一个水稻温敏雄性不育突变体进行形态观察。发现突变体表现完全不育,花药细小且呈白色,I2-KI染色几乎没有观察到可育花粉粒。通过醋酸洋红实验观察花粉发育过程,突变体在单核期已发生明显败育,在成熟花粉期不形成可育花粉。花药半薄切片结果显示,突变体花药中的小孢子在单核期发生败育,伴随绒毡层的提前降解,到了成熟花粉期,药室发生坍塌最终没有成熟花粉粒形成。杂交实验证实其雌配子可育。分期播种实验证明该突变体的育性受到光温条件的调控。(4)以杂合型植株TMS11/tms11为母本,以籼稻品种‘N22’为父本构建F2分离群体。遗传分析结果表明,突变体tms11的不育性状受单隐性核基因控制。利用隐性极端个体和多态性分子标记对不育基因进行初连锁分析和精细定位。将该基因初定位在1号染色体分子标记RM6289和RM493之间,两标记间的物理距离为6.1cM。通过进一步扩大群体和加密分子标记,将基因精细定位在标记RM259和Qi-25之间,区间的物理距离为120-kb。该区间内总共有十七个开放阅读框(Open Reading Frames,ORFs),其中一个ORF的表达模式符合雄性不育突变体的特征,相关结果需经过转基因植株的验证。
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