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CUL4B属于Cullin家族，参与构成Cullin4B-Ring泛素连接酶复合物，即CRL4B复合物。CRL4B复合物可识别并特异性结合多种底物蛋白，泛素化修饰底物蛋白，进而调节多种生理或发育过程。本实验室前期发现CUL4B基因突变导致X连锁精神发育迟滞综合征，患者有智力低下、失语、身材矮小、外周血中单核细胞增多等症状。神经系统特异性Cul4b基因敲除小鼠（Cul4b Nestin-Cre小鼠）同样表现出学习记忆能力缺陷，提示CUL4B在神经系统发育过程中起非常重要的作用。但CUL4B基因突变导致精神发育迟滞综合征的机制目前尚未明确，因此需进一步探讨CUL4B在神经系统发育过程中的作用。本论文主要从两个方面进行探讨:第一，明确Cul4b基因缺失后神经元树突长度及复杂程度是否发生变化，神经元突触密度是否发生变化;第二，明确Cul4b基因缺失后神经系统发育相关蛋白的表达情况。本文主要分为以下几个部分: 第一部分:Cul4b基因缺失导致神经元树突形态及突触密度异常 为明确Cul4b基因缺失后神经元树突长度及复杂程度是否发生变化，以及神经元突触密度是否发生变化，将Cul4b基因打靶小鼠与Nestin-Cre转基因小鼠交配以获得神经系统特异性Cul4b基因敲除小鼠（Cul4bNestin-Cre小鼠）及同窝对照小鼠，从胚胎期18.5天的小鼠大脑皮层中分离神经元并进行体外原代培养。首先观察了神经元动态发育过程，对体外培养第一天(DIV1)、第二天(DIV2)和第四天(DIV4)的神经元利用神经元特异性标记物(Neuro-ChromTM Pan Neuronal Maker)进行免疫染色，发现与对照小鼠相比，Cul4b敲除小鼠神经元突起生长略慢。体外培养14天(DIV14)后使用树突特异性标记物MAP-2进行免疫荧光染色，并使用Image J软件分析树突总长度，结果发现Cul4b基因缺失的神经元树突总长度明显变短。使用Sholl analysis软件分析神经元树突分枝复杂程度，发现Cul4b基因缺失的神经元树突分枝复杂程度明显降低，提示CUL4B可能影响神经元树突形态。 为明确Cul4b基因缺失后神经元突触密度是否发生改变，利用免疫荧光实验检测了四个突触相关蛋白Synapsin1、PSD95、GAD67和Gephyrin的表达情况，然后对从胞体开始100μm树突长度内阳性突触数量进行统计，结果发现Cul4b基因缺失的神经元中Synapsin1、PSD95、GAD67和Gephyrin阳性突触密度均降低，Synapsin1/PSD95共染的突触密度及GAD67与Gephyrin共染的突触密度也降低，提示CUL4B可能在突触的形成过程中发挥作用。 以上结果提示CUL4B基因突变导致精神发育迟滞可能与神经元树突形态改变及突触密度降低有关。 第二部分:Cul4b基因缺失导致新生小鼠前脑组织中NEFM表达降低 实验室前期利用蛋白质组学实验发现，敲除Cul4b基因后小鼠脑组织中有多个神经系统发育相关蛋白的表达发生改变，其中部分蛋白与突触形成或突触囊泡相关。分别提取了新生（P0天）、发育阶段（2周和1个月）和成年期(2个月)的神经系统特异性Cul4b基因敲除小鼠（Cul4b Nestin-Cre小鼠）及同窝对照小鼠的前脑组织蛋白，利用Western Blot实验检测了NEFM、NEFL、SNAP-25、Synaptotagmin-1、STXBP1、VTI1B、Drebrin等蛋白的表达水平。结果发现与对照小鼠相比，神经系统特异性Cul4b基因敲除小鼠的前脑组织中除NEFM在P0天表达明显降低，其他神经系统发育相关蛋白的表达没有明显的变化。Cul4b基因缺失后NEFM仅在新生小鼠的前脑组织中表达降低，而在发育阶段及成年期海马、皮层和胼胝体中表达均未发生变化，提示Cul4b基因缺失对NEFM表达的影响仅发生在小鼠胚胎发育阶段。随后在新生的神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠（Cul4bNse-cre小鼠）中验证了以上结果，同时Cul4b基因缺失的体外培养的原代神经元中NEFM的表达也降低。 此外，提取了新生（P0天）神经系统特异性Cul4b基因敲除鼠与同窝对照小鼠前脑组织RNA，用实时定量PCR的方法检测了NEFM的mRNA表达情况，发现Cul4b基因缺失后NEFM的mRNA表达并未降低，提示CRL4B对NEFM表达的调控可能发生在转录后水平。