目的:骨关节炎(OA)是一种发病率较高的全球性疾病,它不仅会增加疾病人群的致残率,同时还会对社会造成巨大的经济负担。OA的主要临床表现为关节肿胀疼痛,骨赘增生,关节变形同时伴有不同程度的活动障碍,对患者运动能力造成极大的损害。OA的病理变化主要为软骨细胞的大量死亡,软骨基质的过度降解以及软骨下骨过度侵袭,最终导致一系列的临床症状。目前,OA的发病机制十分复杂且尚不完全清楚。多种因素,如:肥胖,机械损伤,遗传因素等在骨关节炎的发生、发展过程中都起到非常重要的作用。炎症是OA的主要病理改变,多种因素都会造成软骨组织中炎症因子的释放,从而激活软骨组织中的炎症反应,对软骨进一步地破坏。组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)是一种重要的转录调节蛋白,它既可以作用于组蛋白的乙酰化位点来调节靶基因的转录翻译活动,还可以与某些非组蛋白相互作用,调节相应的信号通路。在正常的生理情况下,HDAC3在软骨的形成和发育过程中发挥重要作用。此外在病理状态下,HDAC3可以促进某些疾病中炎症因子的释放,加重炎症损伤。但是,HDAC3在OA中的作用尚不明确。目前,OA的治疗手段比较局限,而且只能起到延缓OA发展的作用。运动疗法是一种效果比较明显且花费较少的OA治疗方法,这种疗法是把运动应力通过膝关节传导作用于软骨细胞,从而使软骨细胞在机械力的影响在加速自身代谢和修复,对抗OA的组织损伤。然而,运动疗法对OA作用的分子机制尚不完全清楚。目前,运动可以调节HDAC3的含量及活性,从而调节炎性因子和炎性蛋白在疾病中的表达;NF-kappaB作为经典的炎症转录因子,在OA的炎症反应中具有重要的作用,HDAC3可以调节NF-KappaB的转录活性,改变NF-Kappa B下游炎性分子和炎性蛋白的表达。在运动治疗OA的过程中,运动是否是通过HDAC3/NF-kappa B通路实现治疗作用,目前尚不明确。在课题组的前期工作基础上,本课题首先建立不同时期OA大鼠模型,观察不同严重程度OA大鼠膝关节中HDAC3的含量变化以及HDAC3与软骨炎性损伤的相关性。其次通过大鼠跑台对OA大鼠施加不同强度运动负荷,探讨不同运动负荷对OA大鼠膝关节中HDAC3的含量变化影响及与其所产生的不同治疗效果的相关性。同时应用HDAC3抑制剂(RGFP966)进行关节腔注射,明确HDAC3在OA运动疗法中的作用。我们又将动物体内实验结果进行体外实验验证,从正常SD大鼠膝关节分离软骨细胞并进行原代培养。通过向培养基中加入RGFP966,我们观察其对IL-1β刺激下的软骨细胞中HDAC3/NF-kappaB通路的影响及炎性指标的改变。本课题最终证实了HDAC3在OA中起到的作用,同时也进一步阐明了OA运动疗法的机制,HDAC3抑制剂的应用也为OA的治疗提供了一个潜在的新方向。研究方法:1.建立SD大鼠OA模型,采用碘乙酸(monosodium iodoacetate,MIA)关节腔注射方式制备OA大鼠模型。2.制备不同周数OA大鼠模型,观察大鼠膝关节中HDAC3及相关蛋白在RNA和蛋白水平的表达,同时对膝关节进行组织学观察和评分。3.根据相关文献,我们对OA大鼠施加不同强度的跑台运动:不同的跑台速度,相同的时间和相同的坡度。观察大鼠膝关节中HDAC3及相关蛋白在RNA和蛋白质水平的表达,同时对膝关节进行组织学观察,评分。4.制备OA大鼠模型,同时向关节腔内注射HDAC3抑制剂RGFP966,探究HDAC3抑制剂在体内对于OA炎症的作用;检测大鼠膝关节中相关炎性蛋白和通路蛋白的含量变化,并进行膝关节的组织学评分。5.大鼠膝关节软骨中相关蛋白表达检测:(1)运用PCR方法检测组织中HDAC3和相关分子在RNA水平的表达;(2)运用组织化学染色法和Western-Blot方法检测组织中HDAC3和相关分子在蛋白质水平的表达。6.从SD大鼠膝关节分离原代软骨细胞进行原代培养并运用二型胶原染色进行软骨细胞鉴定,同时加入IL-1β模拟体外炎症模型7.探究HDAC3在IL-1β刺激下的软骨细胞中的致炎作用及HDAC3抑制剂RGFP966对软骨细胞炎症和相关通路的影响:选择第3代原代软骨细胞,并使用IL-1β进行体外诱导。用CCK-8活力实验选择RGFP966最佳作用浓度和作用时间。观察RGFP966对软骨细胞炎症和相关炎症通路的影响。运用核质蛋白分离和Western-Blot方法检测软骨细胞中相关蛋白的表达。结果:1.SD大鼠膝关节腔内注射MIA可以引起明显的OA症状。(1)OA大鼠膝关节大体观察:正常对照组可见膝关节软骨表面光滑完整,关节腔内少量透亮关节液;OA模型组(1周组)可间关节软骨失去光泽,并且随着时间的增加而加重,4周时,可见软骨被明显破坏,关节腔内有粘稠浑浊甚至血型关节液。(2)组织学染色结果:正常对照组切片HE染色可见关节表面完整平滑,潮线正常,软骨细胞排列规律,甲苯胺蓝染色可见软骨基质呈均一致密蓝色;OA模型组切片HE染色可见关节表面粗糙,软骨细胞排列紊乱,同时随着时间增加,软骨破坏严重,可出现大面积缺损,甲苯胺蓝染色缺失,软骨细胞死亡消失,甚至失去正常关节结构。(3)影像学观察:对大鼠膝关节进行X-ray检查:正常大鼠膝关节结构清晰完整,关节间隙正常;OA大鼠膝关节结构模糊不清,关节破坏严重,失去正常结构。2.OA大鼠中HDAC3和相关炎症指标较对照组升高,且呈现一个时间依赖性的增长趋势。(1)不同时期OA大鼠模型的影像,组织学结果:X-ray结果可见OA模型组膝关节破坏,结构模糊,4周模型组破坏明显;HE及甲苯胺蓝染色显示随时间增加,软骨面破坏逐渐加重,甚至失去正常结构;Mankin及OARSI评分显示膝关节评分随时间增加而增加,4周模型组评分最高。(2)不同时期OA模型中HDAC3的含量变化:通过Western-Blot,PCR和免疫组化检测HDAC3含量差异,我们发现HDAC3在蛋白质和RNA水平均随着时间增加而升高,4周时均具有显著差异。(3)不同时期OA模型中二型胶原和相关炎性因子的含量变化:通过Western-Blot,PCR和免疫组化方法,我们发现CollagenⅡ随时间增加而减少,MMP13,NF-kappaB和ADAMTS5随时间增加而增加。3.中等运动强度具有较好的软骨修复作用,可以明显地抑制OA大鼠膝关节中的炎性反应和HDAC3的细胞核内含量。(1)大鼠膝关节的组织学染色及评分。OA大鼠的膝关节切片甲苯胺蓝,HE染色结果显示中等强度组的关节软骨修复效果较好,软骨结构比较完整,软骨基质着色明显,相反,高强度组和OA组的软骨损伤较为严重;Mankin和OARSI评分与组织染色结果趋势基本一致,且差异显著。(2)不同强度运动负荷干预下,中等强度运动组的治疗效果最好,Western-Blot结果显示中等强度运动组与OA组相比CollagenⅡ升高,MMP13含量下降,同时HDAC3和NF-kappaB的入核减弱;PCR结果显示中等强度运动组HDAC3和MMP13等炎性指标跟OA组相比在RNA水平上也明显降低;免疫组化结果与Western-Blot结果趋势相同。4.OA大鼠关节腔内注射HDAC3抑制剂RGFP966,可以起到抑制炎症反应,治疗OA的效果。(1)OA大鼠膝关节的组织学染色和评分:大鼠膝关节切片的HE及甲苯胺蓝染色显示RGFP966注射组软骨修复效果明显,关节结构较OA组完整,软骨基质染色面积也明显增多;Mankin和OARSI评分趋势与组织学染色观察结果一致,RGFP966注射组的评分较OA组降低。(2)OA大鼠膝关节HDAC3及相关炎性蛋白表达:通过免疫组织化学染色法,我们观察到在RGFP966作用下,软骨细胞中HDAC3和NF-kappaB的入核减弱,同时CollagenⅡ增加,MMP13等炎性因子减少。5.在IL-1β的刺激下,HDAC3可以促进软骨细胞中NF-kappa B所介导的炎症反应,同时RGFP966在体外实验中具有同样的抑炎作用。(1)选取3代原代软骨细胞,用IL-1β(20ng/m L)刺激软骨细胞,模拟体外炎症。(2)IL-1β(20ng/mL)刺激软骨细胞,通过Western-Blot方法,我们发现细胞呈炎症变化,CollagenⅡ含量下降,MMP13表达升高。(3)IL-1β(20ng/m L)刺激软骨细胞,通过核质蛋白分离和Western-Blot方法,我们发现IL-1β可以促进HDAC3,NF-kappaB入核。(4)在IL-1β(20ng/m L)刺激软骨细胞基础上,加入RGFP966(10μM),Western-Blot结果显示RGFP966可以抑制MMP13的表达。(5)在IL-1β(20ng/m L)刺激软骨细胞基础上,加入RGFP966(10μM),Western-Blot结果显示RGFP966可以抑制HDAC3,NF-kappa B的入核。结论:1.HDAC3参与了OA的致病过程,同时HDAC3可以作为OA严重程度的指示蛋白。2.中等强度的跑台运动具有较好的软骨修复作用,软骨组织中HDAC3的核内表达被抑制。HDAC3是运动治疗骨关节炎的重要靶点。3.体内实验和体外实验中,HDAC3抑制剂RGFP966可以抑制HDAC3,NF-kappaB的核内转移,证实了HDAC3可以促进软骨组织中NF-kappaB介导的炎症反应。4.整个实验验证了OA运动疗法通过HDAC3/NF-kappaB通路来实现对OA的治疗作用。