人类条件致病菌(Human potential pathogens,HPB)在城市水体分布广泛,其引起的发病率和死亡率呈逐年升高趋势,一直备受关注。携带大量HPB的污废水汇集于污水处理厂或未经处理直接排入环境水体,进入受纳河流,易污染水源水并威胁饮用水安全。传统的微生物培养法常用于分析环境样品中HPB的分布、丰度及多样性。然而,环境中HPB的种类繁多且大多无法培养,传统方法难以准确、全面分析环境中的HPB。基于实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,qPCR)技术的分子生物学方法逐步取代培养法,成为当前环境 HPB定量分析的主流方法。但是,该方法也存在通量低、费时费力等显著缺陷。近年来,迅速发展的宏基因组学和高通量PCR技术(HT-qPCR)为全面、快速、高通量检测环境HPB提供了新思路。宏基因组学方法可以通过解析环境样品中所有DNA信息,实现环境HPB的全谱分析。宏基因组学方法一般基于两种目标基因检测HPB:—是基于16S rRNA基因,二是基于标志性基因。本文通过比较两种检测分析方法的准确性及灵敏度,选取了准确性更高、灵敏度更好的16S rRNA 比对分析方法进一步解析了城市水循环关键节点(生活污水、养殖废水、受纳河流、水源水及饮用水)中HPB的丰度与多样性,同时建立了检测多种高危HPB特异性基因的HT-qPCR技术,并分析了该技术的应用性特征。主要研究结果如下:(1)定量添加培养菌株(铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肠道沙门氏菌、嗜水气单胞菌和肺炎克雷伯氏菌)的DNA进行内标法实验,并对结果进行qPCR法验证分析,结果表明在饮用水中,标志性基因比对方法(MetaPhlAn2)检出的铜绿假单胞菌相对丰度与实际加入DNA浓度负相关,说明该方法对部分HPB的检测不准确。在灵敏度方面,16S rRNA基因比对方法对不同HPB的检出/定量限和定量范围与标志性基因比对方法相比均低1～3个数量级,因此其检测的线性范围的较标志性基因比对方法更广,更有利于检测城市水循环节点样品中的低丰度HPB,且和qPCR的检出/定量限较为接近。但是两种方法的最高内标浓度结果均已偏离线性区间,较qPCR法的线性范围更小。综合考虑准确性和灵敏度,16S rRNA 比对方法优于标志性基因比对方法,更适用于城市水循环节点样品中HPB的全面检测。(2)应用16S rRNA基因比对方法探究城市水循环不同节点环境中HPB分布特征,结果表明在生活污水、畜禽养殖废水及水产养殖废水中共同存在氧化木糖无色杆菌等1 1种HPB,且生活污水及畜禽养殖废水共同存在的30种HPB中与粪便污染相关的HPB达15种(拟杆菌属等)。畜禽养殖和水产养殖废水可显著改变其受纳河流中HPB群落结构,生活污水对受纳河流中HPB群落结构影响较小。饮用水处理与输配系统中存在相对丰度较高的嗜水气单胞菌等HPB,常规饮用水处理工艺可显著改变HPB群落结构。城市水循环节点环境中共存在40种高频现、高丰度或高风险HPB,嗜水气单胞菌是唯一同时满足上述三类特性的HPB,其在城市水循环中分布与归趋亟需重点关注。(3)针对城市水循环节点中存在的25种危险度较高的HPB,建立了可同时检测这些HPB特异性基因的HT-qPCR方法,并评价了其应用特征。HT-qPCR方法基因特异性良好,准确性高;针对不同类型HPB的检测限均在103copies/μL DNA,扩增效率处于85%-98%之间,灵敏度较高,与普通qPCR检测值处于同一数量级;且相对标准偏差(RSD)小于0.05,平行样品间重复性较好。应用HT-qPCR检测城市水循环节点样品中HPB发现,饮用水、水产养殖废水、河流底泥等水环境中未检出这些HPB,而在河湖类水环境(水源水、长江水与太湖水等)和污水环境(医院废水、村镇污水以及城市污水等)中均可检出部分HPB,嗜水气单胞菌等9种HPB分别存在于不同的城市水循环节点中。本文比较分析了两种高通量检测HPB的宏基因组学方法(16S rRNA基因比对、标志性基因比对),全面解析城市水循环关键节点(城市污水、畜禽养殖废水、水产养殖废水、受纳河流以及饮用水系统)中HPB分布特征,获得了高频现、高丰度或高风险三类HPB的分布信息,并建立了全面检测嗜水气单胞菌等25种HPB的HT-qPCR方法,相关结果为全面认知和有效防控城市水环境中HPB提供了科学依据和方法学基础。