冠脉旁路移植术因能有效地缓解冠心病患者心绞痛症状并延长寿命而在世界范围内广泛应用。大隐静脉是旁路移植术最常用的血管材料，但移植血管新生内膜增生和随后发生的粥样硬化严重影响其远期疗效。冠脉旁路移植术后第1年有15％的静脉移植血管堵塞；随后5年，每年有1％~2％的移植血管衰败。如何防治静脉移植血管衰败是现今急待解决的难题。血管移植术后移植静脉再狭窄的发生机制十分复杂，其中血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）增殖、迁移和细胞外基质大量沉积是导致血管内膜增厚、管腔狭窄的主要原因。新生内膜增生（neointimal hyperplasia, IH）开始于静脉移植的早期，最终可能导致管腔狭窄或闭塞。IH以中膜VSMC从中膜迁移到内膜为特征。许多生长因子和激素可以通过激活VSMC磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）而激发新生内膜增生。PI3K-Akt-mTOR信号通路可能是调节细胞增殖、迁移和生存的关键通路。RNA干扰技术作为基因沉默的新技术，是一种简单有效的基因沉默工具。由于其高特异性、高效性、高稳定性和可遗传性等特点与其它抑制基因表达的手段相比具有明显的优势。通过RNA干扰技术靶向沉默或下调PI3K-Akt-mTOR信号通路有可能达到防治血管移植术后再狭窄的目的。本摘要分细胞研究和在体研究2部分：目的构建靶向大鼠磷脂酰肌醇3激酶PI3K p110β亚单位编码基因Pik3cb的短发卡状RNA（pU6-Pik3cb-shRNA）真核表达载体，研究其对大鼠胸主动脉VSMC增殖和凋亡的作用。方法采用组织贴块法进行VSMC原代培养，应用相差显微镜和平滑肌肌动蛋白对细胞进行形态学和免疫组化鉴定，选用5～8代的VSMC进行实验。根据Genbank中大鼠Pik3cb序列设计并合成6条shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-1，酶切鉴定和测序正确后经脂质体METAFECTENETM介导染染大鼠胸主动脉平滑肌细胞，经荧光定量PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测基因沉默效果后选取2条有效的shRNA（pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2）进行实验。实验分7组：A组：正常培养的VSMC细胞；B组：转染质粒pU6-Pik3cb-shRNA-1；C组：转染质粒pU6-Pik3cb-shRNA-2；D组：转染质粒pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2各半量；E组：转染阴性对照无序质粒HK；F组：转染阴性对照空质粒；G组：阳性对照渥曼青霉素。应用荧光定量PCR检测VSMC中Pik3cb mRNA的表达；Western Blot检测VSMC中PI3K下游效应分子磷酸化Akt (Thr308)、Akt (Ser473)和磷酸化mTOR (Ser2448)表达的变化；CCK-8法检测pU6-Pik3cb-shRNA对大鼠VSMC增殖的影响；流式细胞仪和TUNEL法分别从形态和数量上检测细胞凋亡状况；免疫组织化学法检测各组细胞中Akt1和磷酸化mTOR (Ser2448)的表达；免疫荧光法检测各组细胞中磷酸化Akt (Thr308)、Akt (Ser473)和PCNA的表达。结果90%原代培养的VSMC的组织块接种存活，培养5代的平滑肌细胞纯度达98%以上。镜下培养细胞呈典型的“峰－谷状”样生长，免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。正确构建了pU6-Pik3cb-shRNA质粒表达载体并成功转染VSMC，48 h、72 h转染率分别为15.7 %、10.1 %；48 h时转染组（pU6-Pik3cb-shRNA-1；pU6-Pik3cb-shRNA-2；pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2各半量组，下同）中Pik3cb mRNA表达分别降低了75.5 %、53.6 %和65.8 %，与对照组相比有统计学意义（P < 0. 05）；转染组中PI3K下游效应分子磷酸化Akt (Thr308)的表达分别降低了74.0 %、51.1 %和65.1 %，磷酸化Akt (Ser473)的表达分别降低了71.7 %、56.9 %和78.6%，磷酸化mTOR (Ser2448)的表达分别降低了74.1 %、51.0 %和62.4 %，与对照组相比有统计学意义（P < 0.05）；CCK-8结果显示pU6-Pik3cb-shRNA抑制VSMC的生长，与对照组相比有统计学意义（P < 0. 05）；流式细胞仪和TUNEL法结果显示转染组中凋亡细胞数目明显增加，与对照组相比有统计学意义（P < 0.05）。免疫组化结果显示转染组中磷酸化Akt (Thr308)阳性面积百分比分别为3.33 %、5.54 %、3.68 %，磷酸化Akt (Ser473)阳性面积百分比分别为1.68 %、4.59 %、3.04 %，磷酸化mTOR(Ser2448)阳性面积百分比分别为1.88 %、4.83%、3.18 %，与对照组相比均有统计学意义（P < 0.05）；TUNEL法结果显示转染组阳性凋亡面积百分比分别为3.86 %、2.97 %、3.43 %，与对照组相比均有统计学意义（P < 0. 05）；免疫荧光结果显示PCNA阳性面积百分比分别为6.85 %、9.59 %、8.38 %，与对照组相比均有统计学意义（P < 0. 05）。结论组织块法简便、可靠，短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞。成功的构建了2条真核表达质粒pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2，两条shRNA均可有效下调大鼠胸主动脉平滑肌细胞Pik3cb mRNA和PI3K下游效应分子磷酸化Akt和mTOR的表达,抑制平滑肌细胞增殖并促使其凋亡，为采用RNA干扰技术靶向沉默Pik3cb防治移植血管再狭窄的基因治疗奠定了基础。目的构建靶向大鼠Pik3cb短发卡状RNA（shRNA）真核表达载体，通过PluronicF-127缓释系统转染大鼠颈静脉移植血管，观察双位点shRNA靶向沉默Pik3cb对PI3K-Akt-mTOR信号通路的影响和其对血管移植术后再狭窄防治作用。方法根据GenBank数据库提供的PI3K p110β亚单位编码基因Pik3cb核苷酸序列，按照shRNA设计原则，设计并合成6条shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-1，构建shRNA真核表达载体。经预实验后挑选出2条有效的Pik3cbshRNA真核表达载体,分别命名为pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2。建立改良大鼠颈静脉颈动脉间置模型，通过Pluronic F-127质粒缓释系统在血管吻合完成后进行局部RNA干扰。实验分6组，每组30只SD大鼠。A组：对照组（25％Pluronic F-127组）；B组：pU6-Pik3cb-shRNA-1组；C组：pU6-Pik3cb-shRNA-2组；D组：1/2（shRNA1 + shRNA 2）组；E组：阴性对照组（pGenesil-1质粒错配shRNA）；F组：阳性对照组（wortmannin）。根据实验分组的不同，将200μL含有50μg shRNA质粒的PluronicF-127凝胶，或50μg wortmannin，或空白Pluronic F-127凝胶均匀地涂抹在移植血管的周围，分别于术后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d取材，HE染色观察新生内膜厚度，新生内膜面积；免疫组化检测磷酸化Akt(Thr308)、磷酸化mTOR(Ser2448)、PCNA表达的高低；TUNEL法检测细胞凋亡。另设一组，局部应用pGenesil-1质粒错配shRNA，于术后1 d、2 d、3 d取材，快速冰冻切片观察转染效果。再设一组，术后3 d取材，荧光定量PCR和Western blot测定Pik3cb mRNA的和其下游磷酸化Akt(Thr308)、磷酸化mTOR(Ser2448)的表达。结果成功构建2条Pik3cb shRNA真核表达载体。移植静脉中膜平滑肌细胞转染效率达60％以上，内皮细胞转染效率达90％以上。pU6-Pik3cb-shRNA和wortmannin转染后Pik3cb mRNA和其下游效应分子磷酸化Akt(Thr308)、磷酸化Akt(Ser473)、磷酸化mTOR(Ser2448)蛋白表达均明显下调：转染组和阳性对照组mRNA相对表达量分别下降了70.3％、51.8％、59.9％和74.8％（P < 0.05），磷酸化Akt(Thr308)表达量分别下降了88％、80.4％、85.6％和90.5％（P < 0.05），磷酸化Akt(Ser473)表达量分别下降了77.8％、70.8％、74.7％和84.1％（P < 0.05），磷酸化mTOR(Ser2448)表达量分别下降了73.4％、62％、70.5％和80.6％（P < 0.05）。各时间点对照组和阴性对照组相比差异均无统计学意义（P > 0.05）。转染组和阳性对照组磷酸化Akt(Thr308)阳性细胞明显减少，以7 d和14 d最为明显，与对照组相比差异有统计学意义（P < 0.05）。14 d时转染组和阳性对照组阳性面积百分比分别为0.57％、0.71％和0.63％和0.69％，而对照组和阴性对照组高达1.72％和1.66％。28 d时转染组和阳性对照组阳性面积百分比分别为0.54％、0.68％和0.65％和0.78％，对照组和阴性对照组高达1.52％和1.47％。各时间点对照组和阴性对照组相比差异均无统计学意义（P > 0.05）。转染组和阳性对照组磷酸化mTOR(Ser2448)阳性细胞明显减少，以7 d和14 d最为明显，与对照组相比差异有统计学意义（P < 0.05）。14 d时转染组和阳性对照组阳性面积百分比分别为0.65％、0.82％和0.74％和0.86％，而对照组和阴性对照组高达1.70％和1.67％。28 d时转染组和阳性对照组阳性面积百分比分别为0.56％、0.72％和0.64％和0.78％，对照组和阴性对照组高达1.52％和1.48％。各时间点对照组和阴性对照组相比差异均无统计学意义（P > 0.05）。转染组和阳性对照组PCNA阳性细胞明显减少，与对照组相比差异有统计学意义（P < 0.05）。28 d时转染组和阳性对照组阳性面积百分比分别为0.64％、0.83％、0.72％和1.24％，而对照组和阴性对照组高达2.31％和2.53％。各时间点对照组和阴性对照组相比差异均无统计学意义（P > 0.05）。转染组和阳性对照组凋亡细胞明显增加，与对照组相比差异有统计学意义（P <0.05）。14 d时转染组和阳性对照组凋亡细胞阳性面积百分比分别为3.19％、2.56％、2.93％和3.64％，对照组和阴性对照组分别为1.45％和1.33％。28 d时转染组和阳性对照组阳性面积百分比分别为2.62％、1.93％、2.28％和2.45％，而对照组和阴性对照组为0.66％和0.84％。各时间点对照组和阴性对照组差异均无统计学意义（P > 0.05）。HE染色显示术后1~2 w新生内膜细胞增生最为明显，各时间点转染组血管内膜厚度、新生内膜面积均较对照组和阴性对照组明显减少（P < 0.05）。对照组在14 d时内膜厚度较1 d增厚了6.8倍，阴性对照组为6.6倍，而转染组仅分别增厚了3.8倍、4.5倍和4.1倍。对照组在14 d新生内膜面积较1 d增加了5.2倍，阴性对照组增加了5.1倍，而转染组仅分别增加了2.8倍、4.6倍和3.1倍。阳性对照组内膜厚度和新生内膜面积在14 d之前一直处于低水平，14 d后因药物效应减弱，内膜厚度和新生内膜面积逐渐增加。结论靶向Pik3cb的shRNA真核表达载体下调PI3K-Akt-mTOR信号通路，有效抑制平滑肌细胞增殖而促进其凋亡，减轻移植血管新生内膜增生，防止移植血管再狭窄形成，为抑制血管移植术后移植血管再狭窄的基因治疗提供了新的思路。