背景:脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)属中医“出血性中风”范畴。历史上,通腑法治疗中风渊源悠久,并曾经广为运用。在现代,以王永炎为代表的通腑化痰治疗急性期中风的学派影响深远。临床中,ICH病人常发病即有大便不通(常持续3~5天,甚至10余天)等腑实之象。此时清者不升,浊者不降,气机升降乖逆,中焦阻塞不通。腑不通则窍不开,热不去必风不熄,平肝潜阳降逆诸法扬汤止沸缓不济急,唯通腑泻热一途釜底抽薪最为适宜。应用通腑法治疗ICH时以大承气汤最为常见,但其对ICH作用的现代医学确切机制尚不很明了。炎症反应与氧化应激是ICH后脑损伤最重要的机制。其中,小胶质细胞激活并获得吞噬性,以清除血肿及脑组织和红细胞坏死时产生的碎片。激活的小胶质细胞也表达和释放促炎性因子,从而加重脑损伤。对ICH后小胶质细胞的激活究竟该抑制还是该促进的争议在持续。另外,对于如何有效地判断小胶质细胞是否激活及其程度,以及其形态、功能改变有否未尽知之规律等等问题,都值得学界研究。在ICH后氧化应激和炎症反应中,Nrf2/Src/MAPKs通路被激活,并对ICH产生影响。那么,大承气汤及大黄素对此是否也有影响?影响如何?阐明这个问题势必将对大承气汤及大黄素作用机制做出深刻揭示。目的:对胶原酶VII诱导ICH模型大鼠给予大承气汤及大黄素灌胃治疗,研究大承气汤及大黄素对ICH的治疗作用,及对N rf2/Src/MAPKs通路的影响及效应,并对ICH后小胶质细胞激活特点、规律进行探讨。方法:本实验对胶原酶VII诱导ICH模型大鼠给予大承气汤及大黄素灌胃治疗,采用组织化学、行为学检测、MRI、免疫组化、多重免疫荧光标记、免疫印迹等技术手段对ICH模型大鼠进行观察及评价。ICH模型复制及其评价:对3月龄SD雄性大鼠脑左侧CPU注射胶原酶VII 0.4U,以复制ICH动物模型。通过MRI结构像、TTC染色、行为学实验(平衡木实验、悬体扭转实验)及一般情况观察等方法来评价胶原酶VII注射后3 d时模型制作效果。大承气汤、大黄素对ICH治疗作用:对胶原酶VII注射大鼠给予大承气汤及大黄素灌胃治疗。观察大鼠一般情况及体重改变,评估其整体疾病状态及恢复程度;行为学实验(平衡木实验、悬体扭转实验)观察ICH后大鼠一侧肌力改变程度,评价其神经功能缺损及恢复;MRI检测血肿体积以评估ICH后脑组织受损范围;普鲁士蓝染色评估ICH病理改变及恢复;MRI波谱检测出血区域脑组织乳酸水平。小胶质细胞的激活及其规律:免疫组化(Iba-1)观察ICH后小胶质细胞的激活及规律;免疫组化(IL-1β、IL-10)及多重免疫荧光标记观察激活的小胶质细胞分泌的细胞因子类型及水平;普鲁士蓝染色观察ICH后小胶质细胞对铁的吞噬及铁沉积,以评价小胶质细胞吞噬功能和铁沉积病理改变。大承气汤、大黄素对ICH后Nrf2/Src/MAPKs通路的影响:免疫印迹观察Nrf2/Src通路的激活及其对下游MAPKs(ERK、JNK、p38)的作用,以及对促炎性因子(IL-1β、TNF-α)及抗炎性因子(Arg1、IL-10)表达水平的影响。结果:ICH模型成功复制胶原酶VII注射后3 d,大鼠一般状况差,体重下降。TTC染色示造模后左侧CPU局部组织结构被破坏。MRI结构像示造模后3 d时,左侧CPU出现高信号区,提示出血。行为学实验示造模后3 d时,大鼠因一侧肌力减退而出现异常行为,表现为平衡能力、动作协调性下降,以及悬体摇摆时躯体扭转偏向于出血侧即左侧。无论是整体状态,还是行为异常,均提示大鼠在胶原酶VII注射后3 d时出现类似ICH后的临床表现,而MRI结构像及TTC染色则直接证实ICH的产生及脑组织结构的破坏。由此肯定,胶原酶VII诱导ICH模型成功。大承气汤、大黄素对ICH的治疗作用行为学实验结果表明大承气汤、大黄素治疗后大鼠一侧肌力减退情况显著改善;普鲁士蓝染色结果表明大承气汤、大黄素治疗后普鲁士蓝染色着色程度在ICH后14 d时达到峰值,并且其加重趋势在28 d时得到根本扭转(此时模型组大鼠着色程度加重趋势无改变);MRI出血灶体积测定结果表明大承气汤、大黄素的治疗可以使ICH后出血灶体积减小(与模型组比较);一般情况的观察及体重增加表明大承气汤、大黄素治疗可以促进ICH后整体恢复。ICH后小胶质细胞的激活Iba-1染色证明ICH后小胶质细胞激活,Iba-1/GFAP双标表明小胶质细胞更接近于病变位置,提示ICH后小胶质细胞的作用可能更早、更快及更重要。同时发现ICH后,小胶质细胞聚集于出血区域及其周围,并在出血及周围区域间形成条带。对小胶质细胞分支条数、胞体面积的分析发现两者均与离出血中心区域的距离呈负相关。通过设计一种新的分析方法,即小胶质细胞激活系数分析方法(MAF),我们能对ICH出血中心及其周围连续区域脑组织的小胶质细胞激活程度进行准确的定量测量。利用MAF,发现在ICH中心区域边缘外400μm范围内,小胶质细胞激活程度与其到出血中心区域边缘的距离呈直线负相关。ICH后,激活的小胶质细胞形态及功能均发生明显改变,且两者大致相适应,提示小胶质细胞形态及功能具有可塑性。小胶质细胞吞噬及分泌功能Iba-1染色及Iba-1/普鲁士蓝双重染色表明在ICH后,激活的小胶质细胞对入脑的红细胞,以及坏死的红细胞和脑组织碎片进行吞噬。尤其是当小胶质细胞在出血区域周围密集形成条带时,这种吞噬功能可以限制血肿扩大,以及铁、血红素等神经毒性物质的扩散。吞噬铁后,小胶质细胞会出现铁过载,铁过载的小胶质细胞会出现特殊的细胞行为以实现铁卸载。多重免疫荧光标记证明ICH 3d时,出血中心区域周围激活的小胶质细胞主要是M1型,且分泌IL-1β,但几乎不分泌TNF-α;在ICH后7 d以前,小胶质细胞M1型激活占主导,而在7 d以后,M2型激活占主导。Nrf2/Src/MAPKs通路的激活、效应及大承气汤和大黄素的影响通过Western Blot检测注射侧CPU促/抗炎性因子表达水平,发现ICH后14 d时,大承气汤和大黄素能下调促炎性因子IL-1β,但不能下调TNF-α;能上调抗炎性因子Arg1和/或IL-10;通过检测MAPKs水平,发现大承气汤治疗后P-ERK/ERK处于高水平,P-JNK/JNK处于低水平,而P-p38/p38水平无变化;大黄素干预后此三者均处于高水平。上述效应由Nrf2/Src通路上调而引发,但在ICH后14 d时,Nrf2和/或Src呈低水平(其原因为p38对Nrf2的下调和促降解作用)。我们同时对注射侧海马作了观察,发现大承气汤、大黄素的治疗可以上调抗炎性因子Arg1、IL-10分泌水平,下调促炎性因子TNF-α水平,IL-1β水平无改变,并下调p38水平(vs Mod)。结果归纳:⑴ICH后,大承气汤和大黄素的治疗能加速行为异常的恢复(即改善神经功能缺损);减小出血灶体积(使更多脑组织受到保护而幸存);使铁沉积病理改变更早开始恢复(从而缩短ICH的病理进程)。⑵通过Nrf2/Src信号通路的激活,大承气汤和大黄素的治疗可以上调抗炎性因子Arg1、IL-10(以促进ICH后脑组织的修复及神经功能的恢复);抑制MAPKs(JNK)而下调促炎性因子IL-1β(以降低ICH后炎症反应从而减少脑损伤);Src还促进ICH后小胶质细胞的迁移及吞噬(以限制血肿扩大,以及铁等神经毒性物质的扩散,从而保护周围脑组织)。⑶激活的小胶质细胞形态及功能均发生明显改变。其吞噬功能可以限制ICH后血肿的扩大,以及铁、血红素等神经毒性物质的扩散(从而保护周围脑组织)。⑷MAF可以对ICH出血中心及其周围连续区域脑组织的小胶质细胞激活程度进行准确的定量测量。⑸铁过载的小胶质细胞进行铁卸载时出现特殊的细胞行为。结论:⑴大承气汤和大黄素的治疗对ICH大鼠具有保护及促进恢复的作用;⑵该作用是经由Nrf2/Src/MAPKs信号通路而实现;⑶激活的小胶质细胞具有形态及功能可塑性,且形态与功能相适应;⑷激活的小胶质细胞吞噬功能可以保护周围脑组织;⑸MAF以定量的方式准确判断小胶质细胞激活程度的高低。