MicroRNA（MiRNA）是一类单链的非编码小RNA,长度为18～25个核苷酸,它在调控动植物体内的基因表达方面发挥着重要作用。最近的一些证据表明,在哺乳动物中发现了源自饮食中的植物miRNA,这些miRNA可能具有调节动物甚至人类靶基因表达的能力。更重要的是,miRNA的异常表达与癌症等多种人类疾病密切相关。因此,miRNA被视为临床癌症诊断、预后和治疗的重要生物标志物,所以对miRNA进行准确且高灵敏的检测显得尤为重要。如何通过简单设计开发出普适于动植物miRNA的高灵敏度分析方法仍存在挑战。本论文建立了两种以miRNA为模板的连接反应结合T7 RNA聚合酶转录扩增机制的分析方法,实现了对miRNA的高灵敏度检测。具体研究内容如下:论文第2章提出了一种结合循环点击化学连接和poly（T）促进的转录扩增机制用于检测植物miRNA。在此设计中,首先通过miRNA介导的点击化学连接反应将两条DNA探针进行热循环连接,从而形成第一步信号放大。接着通过链霉亲和素与生物素的相互作用将含有T7启动子序列的连接产物连接到微球（MBs）表面,并加入含poly（T）的转录模板与连接的DNA探针杂交。然后T7 RNA聚合酶以T7启动子序列下游的poly（T）为模板进行体外转录,产生大量的RNA,形成第二步信号放大。出乎意料的是,我们首次发现poly（T）模板有助于转录生成超长的RNA链,使其转录效率相比于常规模板得到了很大的提高。T7 RNA聚合酶的poly（T）序列依赖性转录行为极大地改善了转录效率,并提高了植物miRNA的检测性能。通过磁分离去除微球后,在上清液中加入RNA嵌入型荧光染料RiboGreen,便可以很容易地定量监测转录产生的RNA。基于高效循环的点击化学连接和poly（T）促进的转录扩增的两步信号放大策略,为谱适于动植物miRNA的分析检测提供了一种新的思路。论文第3章发展了一种基于Cas12a自驱动的crRNA（CRISPRRNA）募集的miRNA生物传感机制（Cas12a-SCR）。在Cas12a-SCR系统中,miRNA介导的锁式探针（padlockprobe）的酶促连接可特异性的触发滚环转录（RCT）反应,从而产生具有大量前体crRNA（precursor crRNA,pre-crRNA）重复序列的长链单链RNA（ssRNA）,并且这些单链RNA可以被Cas12a实时修剪和募集。Cas12a与修剪的成熟crRNA结合形成Cas12a-crRNA复合物。然后,Cas12a-crRNA的“反式切割”活性将被双链DNA（dsDNA）辅助探针激活以高效的非特异性切割单链DNA（ssDNA）报告分子并释放出强烈的荧光信号。核酸外切酶I（ExoI）的引入显著地抑制了非特异性背景信号,因此赋予了 Cas12a-SCR对miRNA检测的高灵敏度,检测限低至0.47 amol,而且由miRNA引发的滚环扩增产物作为crRNA产生的原料,而不是Cas12a-crRNA的靶向序列,因而降低了对双链DNA 靶序列中PAM（protospacer-adjacent motif）位点的序列依赖性,从而极大地扩展了检测的通用性,可将Cas12a-SCR方法应用于不同核酸序列。本论文建立的两种miRNA荧光传感新方法具备检测动植物miRNA的通用性,并且有效的消除了 T7RNA聚合酶的非特异性转录,对miRNA的生物功能研究和疾病的诊断治疗具有重要意义。