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牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)是目前公认的牙周炎最重要的病原菌，将细菌用超声仪粉粹离心后，收集上清液冻干可获得P.gingivalis超声提取物，其致病成分和P.gingivalis基本相同，主要是脂多糖、胞外膜蛋白、牙龈素、菌毛和膜泡等，因此人们常用P.gingivalis超声提取物来研究P.gingivalis的致病作用。而在P.gingivalis众多毒力因子中，牙龈素(gingipain，又称牙龈蛋白酶、卟啉素)是研究证实的最为重要的毒力因子之一。牙周炎的主要病理特征是牙槽骨的吸收，近年来关于骨吸收机制的研究发现核因子-κB受体激动子配体(RANKL)和骨保护因子(OPG)是调节骨吸收的关键因子。为了探讨P.gingivalis超声提取物和牙龈素在牙周组织破坏和牙槽骨吸收中的作用，本课题利用P.gingivalis超声提取物和基因重组牙龈素K(gingipain K)刺激人牙周膜细胞(hPDLCs)，观察hPDLCs的增殖和RANKL/OPG的表达。
1.P.gingivalis超声提取物对hPDLCs增殖的影响
为了监测P.gingivalis超声提取物对hPDLCs增殖的影响，应用组织块法，体外培养hPDLCs，取第5～6代细胞用于实验，以1×l14/ml的密度接种于96孔板：①浓度效应：加入不同浓度P.gingivalis超声提取物(6.25、12.5、25、50μ g/ml)培养24h；②时间效应：加入12.5μg/ml P.gingivalis超声提取物培养24、48、72、96h。对照组为无P.gingivalis超声提取物作用的hPDLCs。采用MTT法检测hPDLCs的增殖。结果显示：当P.gingivalis超声提取物浓度为6.25～50μg/ml，24h后，实验组hPDLCs的增殖受到明显抑制；当P.gingivalis超声提取物浓度为12.5μg/ml，在24～96h内，实验组hPDLCs的增殖均受到抑制。本研究结果说明一定浓度范围内的P.gingivalis超声提取物可抑制体外培养的hPDLCs增殖。
2.P.gingivalis超声提取物对hPDLCs RANKL/OPG表达的影响
为了监测P.gingivalis超声提取物对hPDLCs RANKL/OPG表达的影响，将hPDLCs以5×104/ml的密度接种于25ml培养瓶，加入不同浓度P.gingivalis超声提取物(25、50μg/ml)培养6h，对照组为无P.gingivalis超声提取物作用的hPDLCs。应用Real time PCR检测RANKL和OPG mRNA，同时应用Western blot检测RANKL和OPG蛋白，ELISA检测培养液中OPG蛋白。结果显示：当P.gingivalis超声提取物浓度为25、50μg/ml，6h后，实验组hPDLCs RANKL mRNA及蛋白的表达上调，OPG mRNA及蛋白的表达下调，培养液中OPG蛋白表达无明显变化。本研究结果说明一定浓度范围内P.gingivalis超声提取物可上调hPDLCsRANKL的表达，下调OPG的表达，提高RANKL/OPG表达比率。
3.P.gingivalis牙龈素对hPDLCs增殖的影响
为了检测P.gingivalis牙龈素对hPDLCs增殖的影响，将hPDLCs以1×104/ml的密度接种于96孔板：①浓度效应：加入不同浓度牙龈素K(6.25、12.5、25、50μg/ml)培养24h；②时间效应：加入12.5μg/ml牙龈素K培养24、48、72、96h。对照组为无牙龈素K作用的hPDLCs。采用MTT法检测hPDLCs的增殖。结果显示：当牙龈素K浓度为6.25～50μg/ml，24h后，实验组hPDLCs的增殖受到明显抑制；当牙龈素K浓度为12.5μg/ml，在24～96h内，实验组hPDLCs的增殖均受到抑制。本研究结果说明一定浓度范围内的P.gingivalis牙龈素K可抑制体外培养的hPDLCs增殖。
4.P.gingivalis牙龈素对hPDLCs RANKL/OPG表达的影响
为了检测P.gingivalis牙龈素对hPDLCsRANKL/OPG表达的影响，将hPDLCs以5×104/ml的密度接种于25ml培养瓶，加入不同浓度牙龈素K(25、50μg/ml)培养6h，对照组为无牙龈素K作用的hPDLCs。应用Real time PCR检测RANKL和OPG mRNA，同时应用Western blot检测RANKL和OPG蛋白，ELISA检测培养液中OPG蛋白。结果显示：当牙龈素K浓度为25、50μg/ml，6h后，实验组hPDLCsRANKL mRNA及蛋白的表达上调，OPG mRNA及蛋白的表达下调，培养液中OPG蛋白表达无明显变化。本研究结果说明一定浓度范围内P.gingivalis牙龈素K可上调hPDLCs RANKL的表达，下调OPG的表达，提高RANKL/OPG表达比率。
本研究结果显示一定浓度范围内的P.gingivalis超声提取物和牙龈素K均可呈浓度和时间依赖性抑制体外培养的hPDLCs增殖，并且通过上调hPDLCsRANKL/OPG的表达比率，提高破骨细胞活性，促进牙槽骨吸收。