实验目的:　　疟疾是一种严重危害人类健康的寄生原虫感染性疾病。WHO(2010)的报告显示，全球100多个国家存在疟疾流行，约有33亿人口生活在疟疾风险区，每年因罹患疟疾而死亡的人数高达近100万。为此，WHO等组织已将其列为三大优先防治的感染性疾病之一。大多数疟疾流行区患者存在着两种或多种疟原虫混合感染现象，而且疟疾感染愈后再感染的发生也普遍存在。　　疟疾与其他大多数感染性疾病一样，需要通过免疫效应机制对其控制和消除。关于红内期疟原虫感染的免疫机制，无论人体试验和鼠疟模型研究结果均已证实:CD4+T细胞在抵抗红内期疟原虫感染过程中发挥至关重要的作用。在感染早期，以IFN-γ分泌增加为主的Th1型细胞免疫应答，遏制疟原虫的爆发性增殖，随之，由Th2型细胞辅助B细胞产生特异性抗体，能够有效地清除疟原虫，并防止复发和再燃。由此表明:抗疟保护性免疫有赖于Th1和Th2型免疫应答的有效建立和协调过渡。而树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)对Th细胞应答形式、强度和效应的发挥具有重要的免疫调控作用。DCs可诱导初始T细胞分化为能够分泌IFN-γ的CD4+Th1细胞、分泌IL-4的CD4+Th2细胞或分泌IL-10的调节性T细胞。　　流行病学研究结果显示，间日疟感染有助于减轻恶性疟感染的严重性;对三日疟和恶性疟混合感染的患者进行抗疟治疗，可引起恶性疟的配子体增加;鼠疟模型初次混合感染研究也显示，两种不同种或株疟原虫混合感染时，可互相影响原虫血症水平和生存率。这些结果表明，疟原虫混合感染可以影响疟疾的自然病程和结局。疟疾更易于攻击儿童和新迁入流行区的人群，而流行区老年人群疟疾的发病率明显下降。这提示，反复暴露疟原虫的个体可建立有效的免疫保护，进而控制原虫血症水平并防止重症疟疾的发生。　　有限的研究显示，不同种或不同株疟原虫之间可能存在的交叉抗原，对疟原虫的再感染有一定保护作用。目前，疟疾感染尤其是混合感染后再次感染中固有免疫、适应性免疫及免疫记忆如何发挥效应机制尚不明确。为此，深入探讨疟疾混合感染对再感染的影响机制，不仅能够揭示疟疾流行区疟原虫相互干预的免疫特点，而且可为疟疾疫苗开发及抗疟新药的研制提供必需的前提依据。　　本研究拟建立不同虫株混合感染鼠疟模型，动态、系统观察不同虫株混合感染治愈后对异种虫株再感染的影响，特别是通过对比分析宿主固有免疫和适应性免疫应答特点，旨在揭示疟原虫虫株之间的相互作用的细胞和分子机制，以期为疟疾流行区新的防控策略的确立提供理论依据。　　实验方法:　　1、实验动物及模型构建　　(1)6～8周龄、雌性BALB/c小鼠分别经腹腔接种1×106个疟原虫寄生的红细胞(pRBC):　　组1:P.y17XL　　组2:P.b ANKA　　组3:P.ch AS　　组4:P.vinckei(Pv)　　组5:P.y17XNL　　组6:P.b ANKA+P.ch AS+P.v　　组7:P.b ANKA+P.ch AS+P.v+P.y17XNL　　(2)小鼠初次感染后3天，经口给予青蒿琥脂片60mg/Kg体重，氯喹(90mg/Kg体重，1次/d，连续3d。小鼠治愈，镜检疟原虫寄生的红细胞(pRBC)阴性。初次感染后35天，组2～7再分别接种1×106 pRBC(P.y17XL)。组1为对照组，给予等量生理盐水。　　上述各组小鼠于感染后2天开始经尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，镜检计数红细胞感染率，部分小鼠未治疗用以观察存活率。　　2、脾细胞培养　　无菌取出感染前(0d)和感染后第3d、5d小鼠脾脏，常规方法制备脾细胞悬液，用0.17mol/L NH4C1裂解红细胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640调整脾细胞终浓度为1×107/ml。于24孔培养板中，每孔加入500μl脾细胞悬液于37℃，5％ CO2条件下培养48 h。收集培养上清，-80℃保存，待细胞因子检测。　　3、流式细胞仪分析　　预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，分别加入抗-CD11 c-FITC、抗-CD11b-PE或抗-CD45R/B220-PerCP单抗进行表面染色;或加入抗-CD4-FITC、抗-CD69-PE单抗进行双色分析;或加入抗-F4/80-FITC单抗进行分析。所有样品离心去上清后，用0.5ml细胞染色缓冲液重悬细胞后进行流式细胞仪检测。细胞内染色样品先用抗CD4-FITC和抗CD25-PE单抗进行表面染色，固定透膜后，用抗Foxp3-APC单抗进行胞内染色，用含1％ FCS的PBS洗涤两次并悬浮于500μlPBS中，流式细胞仪(Becton Dickinson，USA)进行检测。　　利用流式细胞仪，激发波长为488nm，每个样品分析20，000个细胞，使用前向散射角(FSC)及侧向散射角(SSC)确定目的细胞群，以阴性对照为参考，将对照管所示的非特异荧光的99％以上作为本底扣除，以二维点阵图显示，分别记录CD11c+CD11b+DCs、CD11c+CD45R/B220+DCs、CD4+CD69+T及F4/80细胞的百分比。以前向和侧向散射角确定淋巴细胞群，CD4+T细胞画门，分析计算CD4+T细胞群内Tregs的百分率。　　4、IFN-γ，TNF-α，IL-10和NO水平检测　　用双抗体夹心ELISA试剂盒分别检测脾细胞培养上清中IFN-γ，TNF-α，IL-10的分泌水平。酶标仪测定450nm处OD值。实验操作按照试剂盒说明书进行，结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，应用SoftMax Pro4.3.1Ls软件分析，计算细胞因子含量(pg/ml)。　　Griess方法检测经培养48h脾细胞上清中NO2-水平。计算其含量(μM)。　　5、血清特异性抗体检测　　感染的BALB/c小鼠血液（原虫血症约达30％）通过灭菌纤维素CF11除去白细胞，用PBS稀释感染血液至10％压积，经45％Percoll(V/V)分离、收集P.y17XL感染红细胞，要求WBC≤5个/10油镜视野，感染率≥60％。感染血样经皂甙裂解、-80℃冷冻30min，40℃水浴解冻，反复冻融3次，PBS洗3次，P17XL颗粒抗原冰浴条件下超声处理，设置电压450V，共超声粉碎15次，每次20s，每次间隔90s，离心，上清即为P.y17XL可溶性抗原，经核酸蛋白分析仪测蛋白质含量，制备约氏疟原虫P.y17XL抗原(10μg/mL)包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜，5％FCS封闭1h，洗涤后加入1∶200稀释的抗血清，37℃2 h。洗涤后加入HRP-羊抗鼠IgG或IgG1、IgG2a(1∶500)100μL/孔，37℃1h，洗涤。加OPD-H2O2底物显色15 min，2 mol/LH2SO4终止反应。酶标仪检测492 nm处OD值。　　6、被动转移鼠模型　　正常BALB/c小鼠经腹腔感染1×106 P.y17XL pRBC后第3～5d，各组小鼠分别经腹腔注射0.6ml/只·天免疫血清，对照组注射等量正常血清，然后观察其虫体血症水平和生存率。　　7、SDS-PAGE电泳　　参照Laemmli方法，样品蛋白上样量为48μg/泳道，转印后取下NC膜，用丽春红S染色10min，适度洗膜，用pH7.5的5％脱脂奶粉-TBS封闭，一抗按1∶40免疫血清分别进行反应，二抗相应为1∶1000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，DAB显色，用扫描仪扫描后保存结果。　　8、统计学分析　　使用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，标本采用独立样本t检验比较分析组内和组间均值差异。P＜0.05为显著差异。　　实验结果:　　1、各种疟原虫MSP1和P25蛋白系统进化树分析　　应用MEGA4.1软件，将有性阶段动合子表面蛋白25(P25)及无性阶段裂殖子主要表面蛋白1(MSP1)基因序列与GenBank中相应序列进行同源性比较，绘制出4种疟原虫MSP1和P25遗传进化关系图（即系统发育进化树）。　　MSP1蛋白进化树显示，约氏疟原虫(XP726257.1)和伯氏疟原虫(AAF13063.1)更为接近，聚为一个分支，聚类后才与夏氏疟原虫(AAA29499.1)聚类。P25蛋白进化树显示，约氏疟原虫(XP725098)和伯氏疟原虫(XP675324)有最高的同源性，共聚于一个分支下，二者聚类后，与夏氏疟原虫(XP745027)聚为一个分支;相比之下，上述3种疟原虫与文[可]氏鼠疟原虫(AAG27290)遗传同源性较远，经4次聚类后聚为同一分支。　　2、不同虫种疟原虫感染后的原虫血症水平和生存率　　初次感染P.y17XL的BALB/c小鼠在感染后第3d，其外周血中开始出现疟原虫感染的红细胞。随后，原虫血症水平迅速持续升高，感染后第5d达峰值时（约60％左右）小鼠开始出现死亡，并于感染后第7d全部死亡。　　小鼠感染P.b ANKA、P.ch AS、P.v及P.y17XNL后第4d，外周血中均出现疟原虫感染的红细胞。此后，红细胞感染率呈不同程度升高，P.ch AS于感染后第9d达到峰值水平，约44％，然后逐渐下降，至第21d虫血症完全消失，小鼠全部存活;P.v于感染后第9d虫血症水平达到峰值约55％，小鼠于感染后第7d开始至第9d小鼠全部死亡; P.b ANKA感染组的原虫血症水平逐渐上升，于感染后第21d达峰值约78％，小鼠于感染后第15d开始出现死亡，至感染后21d全部死亡;P.y17XNL感染后原虫血症水平缓慢上升，感染后第11d达峰值约16％，随后缓慢下降，至第20d原虫血症消失，小鼠全部存活。　　3、同种或异种疟原虫单一或混合感染治愈后P.y17XL再攻击的原虫血症水平和生存率　　小鼠经同种或异种疟原虫单一或混合感染治愈后，用P.y17XL再攻击，感染后第3d起外周血中开始出现疟原虫感染的红细胞，随后红细胞感染率有不同程度的升高。P.ch AS、P.v单独虫株及P.bANKA+P.chAS+P.v混合感染治愈的小鼠再感染P.y17XL的小鼠原虫血症水平较初次感染有不同程度的降低或升高延迟，但最终全部死亡;P.bANKA感染治愈小鼠在P.y17XL再攻击时，小鼠几乎不受P.y17XL的感染，大部分存活; P.y17XNL单一虫种感染治愈后以及P.bANKA+P.chAS+P.v+P.y17XNL混合虫种感染治愈后小鼠再给予P.y17XL攻击时，小鼠小鼠也同样不受P.y17XL的感染，全部存活。　　4、单一虫种与混合虫种疟原虫感染治愈后小鼠脾脏DCs亚群的百分率　　与感染前相比，初次感染P.y17XL的BALB/c小鼠脾脏CD11c+CD11b+DCs及CD11c+CD45R/B220+DCs数量均逐渐增加，感染后第3d即出现有意义的升高。组2～组7小鼠经单一或混合虫种分别感染并治愈后，脾脏CD11c+CD11b+DCs及CD11c+CD45R/B220+DCs数量在再感染后第3～5d未见明显增加趋势，各组感染治愈小鼠在再感染后第3～5d，CD11c+CD11b+DCs、 CD11c+CD45R/B220+DCs数量即显著低于初次感染P.y17XL的BALB/c小鼠。　　5、单一虫种与混合虫种疟原虫感染治愈后小鼠脾脏CD4+CD69+T细胞数量　　与感染前相比，初次感染P.y17XL的BALB/c小鼠脾脏CD4+CD69+T细胞数量逐渐增加，感染后第3d即出现有意义的升高。经单一或混合虫种感染治愈后的小鼠在经历P.y17XL再次攻击后第3～5d，CD4+CD69+T细胞数量低于对照组。　　6、单一虫种与混合虫种疟原虫感染治愈后小鼠脾脏F4/80细胞数量　　与感染前相比，初次感染P.y17XL的BALB/c小鼠脾细胞中F4/80细胞数量逐渐增加，于感染后第3d出现明显升高。经单一或混合虫种感染治愈后的各组小鼠在经历P.y17XL再次攻击后第3～5d， F4/80细胞数量均明显低于初次感染P.y17XL的BALB/c小鼠。　　7、单一虫种与混合虫种疟原虫感染治愈后小鼠脾脏CD4+CD25+FoxP3+T细胞数量　　与感染前相比，初次感染P.y17XL的BALB/c小鼠脾脏CD4+CD25+FoxP3+T细胞数量逐渐增加，感染后第3～5d均出现有意义的升高。经单一或混合虫种感染治愈后的小鼠在经历P.y17XL再次攻击后第3～5d，CD4+CD25+FoxP3+T细胞数量低于对照组。　　8、单一虫种与混合虫种疟原虫感染治愈后小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ，TNF-α，IL-10及NO水平　　与感染前相比，初次感染P.y17XL的BALB/c小鼠细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α、NO及IL-10水平显著增加，感染后第3d即出现有意义的升高，第5d出现一定程度的下降，但仍然显著高于感染前水平。经单一或混合虫种感染治愈后的各组小鼠在经历P.y17XL再次攻击后第3～5d，IFN-γ、TNF-α、NO及IL-10水平均明显低于初次感染P.y17XL的BALB/c小鼠。　　9、单一虫种与混合虫种疟原虫感染治愈后小鼠血清Py17XL特异性IgG抗体及IgG1、IgG2a亚类检测　　与初次感染P.y17XL的小鼠相比，各感染治愈组小鼠血清在P.y17XL再攻击后均可与P.y17XL全虫抗原反应，特异性IgG抗体及其亚类IgG1、IgG2a的抗体滴度明显升高。　　10、单一虫种与混合虫种疟原虫感染小鼠血清与P.y17XL抗原反应结果　　分别用正常血清、P.y17XL、P.b ANKA、P.ch AS、P.v、 P.y17XNL、P.bANKA+P.chAS+P.v及PbANKA+P.chAS+P.v+P.y17XNL感染小鼠血清与P.y17XL全虫抗原进行免疫印迹反应，各组均能识别不同分子量的抗原。其中40kDa的Py17XL抗原能被除P.v感染组小鼠外的其余各感染组小鼠血清特异性识别。40kDa的阳性条带灰度值在P.y17XL感染组最高，P.y17XNL感染组次之。　　11、BALB/c小鼠被动转移免疫血清后感染P.y17XL原虫血症水平和生存率　　被动转移正常血清后，BALB/c小鼠在感染P.y17XL时的原虫血症水平上升较为平缓，生存期有所延长，小鼠于感染后13～14d全部死亡。　　与被动转移正常血清相比，被动转移P.b ANKA、P.ch AS、P.v单一或混合感染治愈鼠血清后，BALB/c小鼠在感染P.y17XL后原虫血症水平上升趋势有不同程度延缓及生存率延长，但无显著变化。小鼠于感染后第14～17d全部死亡。　　被动转移P.y17XNL感染治愈鼠的血清后，BALB/c小鼠在感染P.y17XL后前7d外周血几乎未见疟原虫感染的红细胞，第8d开始原虫血症水平逐渐缓慢上升，直到感染后第10d，原虫血症水平均明显低于经正常血清转移的小鼠。　　结论:　　1.疟原虫单一或混合感染小鼠对同/异种株疟原虫再感染具有程度不一的抵抗力;　　2.与P.y17XL初次感染相比，同种或异种疟原虫单一或混合感染后P.y17XL再攻击小鼠，其免疫细胞分化和活化程度及相关免疫分子产生水平明显下降;　　3.针对P.y17XL再感染，P.y17XNL单一或与异种疟原虫混合感染治愈后产生的IgG，尤其是其IgG1特异性抗体发挥关键的保护性免疫效应。