系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种自身免疫性结缔组织病。由于体内有大量致病性自身抗体和免疫复合物，造成组织损伤，临床可出现多个系统和脏器损害的症状，同时还伴有血细胞减少、淋巴结和脾肿大等。本病女性约占90％，常为育龄妇女。本病的病程迁延，常见缓解和发生交替。SLE的病因和发病机制尚未完全清楚，一般认为其诱因可能包括遗传因素、性激素、药物和病毒感染等。在各种因素启动自身免疫应答的情况下，加之机体的调控系统发生紊乱，使自身免疫的发生、持续和强度失控，则可能发生SLE。几乎所有SLE患者均伴有不同程度的肾脏改变，即发生狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)。约一半患者出现临床症状，表现为急性肾炎、急进性肾炎、隐匿性肾小球肾炎、慢性肾炎和肾病综合征，其中，以慢性肾炎和肾病综合征最为常见。随着病程的发展，LN患者可出现大量蛋白尿、血尿、各种管型尿、氮质血症、水肿和高血压等，晚期发生尿毒症，是SLE患者死亡的常见原因。LN目前尚不能治愈，治疗后只能达到一定程度地缓解，尤其是病程较长、反复复发的病例在治疗后仍会有持续的蛋白尿、血尿及其它尿沉渣异常和肾功能损害等表现。LN的治疗是在最大的治疗利益和最少的药物副作用之间寻求平衡。目前临床对LN的治疗主要是采用糖皮质激素和细胞毒类药物。联合应用环磷酰胺和糖皮质激素治疗LN有较好的疗效，但是在治疗过程中药物的副作用和合并症、患者对治疗耐受性差等问题较为突出。而新型免疫抑制剂环孢素A(cyclosporin A，CsA)、霉酚酸酯(mycophenolic mofetil，MMF)的应用虽使LN患者的预后有了明显改善，但它们选择性不高，对免疫系统具有普遍性抑制作用，因此具有不容忽视的副作用。近年研究表明，Th1／Th2细胞的失衡在SLE发病中起着重要的作用，其中，由于诱导向Th1细胞分化的一系列细胞因子及其受体水平的降低和细胞因子间平衡失调，许多SLE患者表现为Th1功能下降，Th2功能相对占优势。因此，开发针对Th1／Th2平衡调节的药物是当前免疫药理学研究的热点和重点攻关方向之一。Linomide(roquinimex，LS2616)是由瑞典AB LEO制药公司开发一种Th1／Th2平衡调节剂，对多种自身免疫病的动物模型均有较好的治疗作用。Linomide在美国作为治疗多发性硬化症的在研新药(investigational new drug，IND)曾进入Ⅲ期临床试验，但由于发现较为严重的心脏毒性被提前终止。但是，多家实验室仍在对linomide进行结构改造以期发现高效低毒的新型免疫调节剂。本实验室亦与化学合成实验室合作，由恽榴红研究员领导的研究小组负责linomide的结构改造、样品合成，得到一系列4-羟基喹啉-3-羧酰胺类似物，而我们则对所获得化合物进行免疫活性筛选和评价。一、4-羟基喹啉-3-羧酰胺类似物的活性筛选针对linomide的作用特点，并考虑到其毒性因素，我们首先采用小鼠淋巴细胞增殖反应在体外对linomide类似物进行免疫活性初筛。Linomide类似物共计接入124个，由于溶解度的原因，共对其中86个化合物进行了免疫活性初筛。结果表明，86个化合物中有38个作用与linomide相似，体外应用具有免疫抑制活性。进而，采用MTT法对上述38个化合物对小鼠脾淋巴细胞的毒性作用进行了初筛。结果表明，H1521、H0418、H0215、H1619、H0216、H1921、H0715等七个化合物在1～100μg／ml浓度范围内对小鼠脾淋巴细胞无明显毒性作用或毒性低于linomide。在此基础上，进一步观察了H1521等七个化合物对小鼠迟发性超敏反应(delayed type hypersensitivity，DTH)的影响。结果表明，化合物H1521和H0418的作用与linomide相似，明显增强小鼠DTH；化合物H0215、H0216、H1619和H0715对小鼠DTH则无明显影响。同时，检测了小鼠脾细胞培养上清Th1／Th2细胞因子的水平，结果表明，H1521和H0418能显著增加Th1细胞因子IFN-γ分泌，对Th2细胞因子IL-4分泌无明显影响，提示H1521和H0418能调节Th1／Th2平衡，具有较好的开发前景。因此，在后续的实验中，我们选择化合物H1521，对其抗自身免疫性肾炎的活性进行了评价，并对其作用机理进行了初步探讨。二、H1521对小鼠实验性自身免疫性肾炎的疗效评价本研究选用的小鼠自身免疫性肾炎模型是一种慢性移植物抗宿主病(chronicgraft-versus-host disease，cGVHD)病理模型，该模型具有与人类SLE相似的病理生理学变化和临床表现，如Th1／Th2细胞失衡，B细胞异常活化产生自身抗体，免疫复合物沉积介导血管球性肾炎，因此常被用于自身免疫性肾炎发病机理、防治药物及药物作用机理的研究。实验分为6组，分别为正常对照组，cGVHD模型对照组，cGVHD模型+linomide 32mg／kg治疗组，cGVHD模型+H1521三个剂量(8、16和32mg／kg)治疗组。cGVHD通过(C57BL／6×DBA／2)F1(BDF1)小鼠尾静脉注射DBA／2小鼠脾细胞而诱导，共2次，间隔7d。第二次淋巴细胞注射3d后开始灌胃给药，每日一次，连续10w，分别于造模后2、4、6、8 w测定血清肌酐、胆固醇、甘油三酯水平和尿蛋白水平，并于给药结束后处死动物进行肾脏病理学检查。结果表明，造模后8w，模型对照组约60％小鼠出现＞1~+(30mg／dl)蛋白尿，10w时约80％小鼠出现蛋白尿。H1521治疗组尿蛋白发病率均明显低于模型对照组，其中，造模8w时各治疗组尿蛋白发病率均低于20％，造模10w时，H1521 16和32mg／kg治疗组尿蛋白发病率较模型对照组降低约一半。模型小鼠在8w后出现明显的血生化指标异常，表现为血清肌酐、胆固醇和甘油三酯水平显著升高，H1521能有效纠正血生化指标异常。给药结束时进行肾脏病理学检查发现，模型对照组小鼠肾脏组织结构已显著破坏，肾小球数目明显减少，在不同的肾小球或同一肾小球的不同节段，出现类型不同、新旧不等的病变，如系膜增生、肾小球基底膜增厚、纤维素样坏死等。肾小管及间质出现大量嗜伊红的蛋白样物质沉积。给予H1521对上述病理变化具有明显改善作用。上述研究结果表明，H1521对小鼠实验性自身免疫性肾炎具有较好的治疗作用。三、H1521对自身免疫性肾炎小鼠治疗作用的机理研究在确定H1521对小鼠自身免疫性肾炎疗效的基础上，针对肾炎发生发展的主要病理生理学环节及关键分子，观察了H1521对Th1／Th2细胞平衡、B细胞活化、巨噬细胞活化、性激素水平等方面的影响，旨在探讨H1521防治自身免疫性肾炎的作用机理。1．H1521对Th1／Th2平衡的影响首先采用RT-PCR方法检测小鼠脾脏Th1／Th2细胞因子mRNA表达情况，结果表明，模型小鼠脾脏IL-4、IL-10mRNA表达增加，IFN-γ、IL-2表达未见明显变化。给予H1521对细胞因子mRNA表达未见明显影响，而linomide对IL-10mRNA表达有轻度的抑制作用。然后采用ELISA法观察Th1／Th2细胞因子蛋白表达的变化，与文献报道一致，模型小鼠脾细胞培养上清中Con A诱导的IFN-γ分泌显著降低，H1521和linomide能使IFN-γ的分泌恢复至正常水平，而IL-4水平在各实验组未见明显差异，提示cGVHD模型小鼠Th1功能下降，Th2功能相对占优势，H1521具有改善或恢复Th1功能的作用。由于IgG1水平反映体内IL-4的变化情况，而IgG2a水平则反映体内IFN-γ的变化情况，因此接下来我们又通过检测小鼠血清中IgG1和IgG2a水平，进一步考察了H1521对肾炎模型小鼠Th1／Th2平衡的影响。结果表明，造模8w时，肾炎小鼠血清IgG1水平显著升高，IgG2a水平未见明显变化，提示存在Th2过度活化；10w时，IgG1仍维持在较高水平，IgG2a则显著降低，提示Th2过度活化的同时，又出现了Th1分泌缺陷。H1521可升高IgG2a水平，对IgG1影响不明显，进一步提示H1521可通过恢复Th1功能而改善肾炎模型小鼠Th1／Th2失衡状态，这可能是其发挥治疗小鼠自身免疫性肾炎作用的机理之一。进而，通过检测调控Th1／Th2细胞分化的关键性转录因子T-bet／GATA-3mRNA表达情况，探讨H1521调节或改善Th1／Th2平衡的可能途径。其中，T-bet选择性表达于Th1细胞，促进Th1而抑制Th2分化；GATA-3则相反，选择性表达于Th2细胞，促进Th2分化而抑制Th1分化。本研究采用RT-PCR方法检测了小鼠脾脏T-bet／GATA-3mRNA表达情况，结果表明，模型小鼠脾脏T-bet表达显著降低，GATA-3表达明显升高，提示模型小鼠存在Th2偏移。给予linomide仅降低GATA-3表达，而给予H1521不仅降低GATA-3表达，还恢复T-bet表达至正常水平，提示H1521可通过促进T-bet表达，同时抑制GATA-3表达而促进Th1分化，这可能是H1521调节肾炎模型小鼠Th1／Th2平衡的作用途径之一。在机体内，Th细胞分化受到多种因素的调控，如抗原类型和浓度、抗原提呈细胞类型、黏附分子、局部细胞因子微环境等。为了进一步明确H1521对Th细胞分化的影响，我们又采用免疫磁珠技术分选获得CD4~+T细胞，在体外观察了H1521对CD4~+T细胞的直接作用。首先采用阳性选择分选方法分选DBA／2小鼠CD4~+T淋巴细胞后，给予anti-CD3及anti-CD28进行刺激，观察H1521对活化Th细胞IFN-γ／IL-4分泌的影响。结果表明，100μMH1521显著增加IFN-γ分泌，对IL-4分泌无明显影响，使IFN-γ／IL-4比值升高；linomide虽然也使IFN-γ／IL-4比值升高，但与H1521不同，它使IFN-γ和IL-4分泌均受到抑制。这一结果提示H1521能直接促进CD4~+T细胞Th1分化，而linomide则通过对Th1／Th2的不均衡抑制而表现为相对的Th1优势。接下来对体外分选获得的CD4~+T淋巴细胞给予anti-CD3及anti-CD28进行刺激，分别加入Th1极化诱导条件(rIL-12、anti-IL-4、rlL-2)和Th2极化诱导条件(rIL-4、anti-IL-12、rIL-2)诱导CD4~+分别进行Th1／Th2极向分化，观察H1521对Th1／Th2分化T细胞IFN-γ／IL-4分泌的影响。结果表明，H1521进一步增加Th1分化细胞IFN-γ分泌，而对Th2分化细胞IL-4分泌无明显影响，提示H1521可不依赖于抗原提呈细胞增强Th1细胞功能。而linomide对Th1分化细胞IFN-γ和Th2分化细胞IL-4分泌均无明显影响，表明linomide的对Th平衡的调节作用主要受环境因素的影响。综上所述，H1521在肾炎小鼠体内及体外中性(anti-CD3／anti-CD28刺激)和Th1诱导条件下均能促进Th1分化，增加细胞因子IFN-γ产生，而对IL-4产生无明显影响，表明H1521可能为一种选择性的Th1诱导剂。2．H1521对B细胞功能的影响自身抗体的大量产生是LN的重要致病因素，因此采用ELISA法检测了H1521对自身免疫性肾炎小鼠自身抗体水平的影响。模型小鼠在造模2w后血清抗核抗体和抗双链DNA抗体水平显著升高，并在10w内一直维持在较高水平。给予H1521对血清自身抗体水平无明显影响。同时观察了H1521对B细胞活化的影响，结果表明，模型对照小鼠B细胞表面MHCⅡ分子荧光强度明显升高，提示存在B细胞异常活化，而H1521对此无抑制作用。以上实验结果表明，H1521对B细胞活化和自身抗体产生均无明显抑制作用，提示B细胞可能不是H1521治疗cGVHD时的靶细胞。3．H1521对巨噬细胞炎性细胞因子产生的影响由于H1521对狼疮小鼠血清自身抗体水平影响不明显，说明在H1521的治疗过程中，尽管存在免疫复合物的形成，但还不足以引发严重的肾脏病理改变。那么，我们推测在这一过程中，抑制炎性介质产生可能是H1521的重要作用环节之一。因此，采用ELISA法检测了H1521对肾炎小鼠腹腔巨噬细胞炎性细胞因子TNF-α产生的影响。结果表明，模型小鼠存在巨噬细胞的异常活化，自发及LPS诱导的TNF-α分泌均显著高于正常小鼠；H1521给药组LPS诱导的TNF-α分泌显著降低，提示抑制炎症反应可能是H1521发挥治疗小鼠自身免疫性肾炎作用的另一个重要作用途径。我们进一步在原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞上观察了H1521的作用。结果表明，在原代培养的巨噬细胞上，H1521在0.5～100μM浓度范围内抑制LPS诱导的TNF-α分泌，而在RAW264.7巨噬细胞上，H1521对未经LPS刺激的TNF-α自发分泌无明显影响，但在50～200μM浓度范围内能浓度依赖性地抑制LPS诱导的TNF-α分泌，提示H1521可通过抑制巨噬细胞分泌炎性细胞因子而发挥抗炎作用。为揭示H1521抑制炎性反应的可能途径，本研究进一步又考察了H1521对LPS刺激的RAW264.7细胞ERK1／2、JNK、p38和NF-κB等信号分子活化的影响。采用westernblotting法检测ERK1／2、p38和JNK激酶的活化情况，结果表明，ERK1／2、p38和JNK在给予LPS刺激15min后迅速活化，pERK1／2、p-p38和p-JNK水平显著升高，但在30min后基本恢复正常。H1521在50μM和200μM浓度时能显著降低p-JNK和p-p38水平，且H1521效能高于linomide。对于p-ERK1／2，H1521显著抑制其表达，而linomide则增加其表达。同时，采用凝胶阻滞电泳和报告基因分析分别检测NF-κB与DNA结合的能力及其转录活性。结果表明，LPS能增加NF-κ3与DNA结合的能力，并刺激NF-κB转录活性提高约6倍。H1521在50μM和200μM浓度时能显著抑制NF-κB与DNA结合，并在200μM时显著抑制其转录活性。上述结果提示，抑制ERK1／2、JNK、p38和NF-κB等信号分子的活化可能是H1521发挥抗炎作用的可能途径之一。综上所述，H1521能直接抑制巨噬细胞炎性细胞因子TNF-α产生，表明抑制炎症反应亦是H1521治疗小鼠自身免疫性肾炎的重要环节之一。4．H1521对性激素水平的影响LN是性别相关疾病，雌激素可加重LN病情。因此，在本研究中我们采用化学发光法同时检测了小鼠血清中雌二醇水平。结果表明，肾炎小鼠血清雌二醇水平显著升高，给予H1521能明显降低小鼠血清雌二醇水平，提示降低小鼠雌激素的水平可能也是H1521治疗小鼠自身免疫性肾炎取得良好疗效的重要原因之一。通过以上研究，本论文主要得出以下结论：1．通过对linomide衍生的86个4-羟基喹啉-3-羧酰胺类似物进行体外免疫活性筛选和初步淋巴细胞毒性评价，确定其中H1521、H0418等7个化合物毒性较低且具有免疫抑制活性；进而考察了这7种化合物对小鼠DTH的作用，结果表明H1521和H0418能明显增强小鼠DTH，且具有调节小鼠Th1／Th2平衡的作用，提示二者具有较好的开发前景。2．化合物H1521能降低实验性自身免疫性肾炎小鼠的尿蛋白，改善其血清肌酐、胆固醇、甘油三酯水平的异常，并能明显减轻模型小鼠肾脏组织病理学损害程度，提示H1521对小鼠实验性自身免疫性肾炎具有明显治疗作用。3．H1521能促进自身免疫性肾炎小鼠Th1细胞因子分泌，且能促进调控Th1分化的转录因子T-bet mRNA表达，抑制调控Th2分化的转录因子GATA-3 mRNA表达。体外实验进一步证实，H1521能促进CD4~+T细胞向Th1分化，并使己分化的Th1细胞IFN-γ分泌功能增强，提示H1521为一个选择性的Th1诱导剂，恢复Th1功能可能是H1521发挥治疗小鼠自身免疫性肾炎作用的机理之一。4．H1521对自身免疫性肾炎小鼠B细胞活化和自身抗体产生均无明显影响，提示B细胞可能不是H1521治疗自身免疫性肾炎的靶细胞。5．H1521能抑制自身免疫性肾炎小鼠腹腔巨噬细胞炎性细胞因子TNF-α分泌，且可通过抑制ERK1／2、p38和JNK、NF-κB等信号分子活化抑制炎性细胞因子分泌。提示通过抑制巨噬细胞炎性细胞因子分泌可能是H1521治疗小鼠自身免疫性肾炎的重要环节之一。6．H1521能明显降低自身免疫性肾炎小鼠血清雌二醇水平，提示降低小鼠雌激素的水平可能也是H1521治疗小鼠自身免疫性肾炎取得良好疗效的重要原因之一。