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研究背景瘢痕疙瘩(Keloid)是皮肤损伤形成的异常瘢痕组织,多在胸前或肩后呈进行性增长,色红或暗红。治疗方法有口服药物、同位素照射、注射药物等。瘢痕疙瘩病因广泛,致病机制不明确,有肿瘤坏死因子的异常调节,生长因子的异常表达,细胞凋亡通路的异常表达等,细胞内的表达机制尚不清楚。但有前期学者实验表明,瘢痕疙瘩的形成与K基因结合核因子(NF-κB)通路相关。细胞内NF-κB通常为失活状态,当出现脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激时,细胞膜表面的肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor,TNF)与细胞内的蛋白相结合,激活下游NF-κB通路使核因子κB(inhibitor of NF-κB,IκB)的抑制蛋白泛素化后降解,从细胞质进入细胞核。肿瘤坏死因子受体6(TRAF6)主要参与NF-κB的调控的细胞质内的蛋白,可以通过泛素化作用参与到通路中,将细胞质内的多聚体复合物解离为活性二聚体,转入细胞核内启动通路的下一步。TRAF6相关的NF-κB通路为瘢痕疙瘩的治疗提供了新的研究方向。研究目的1.通过HE染色了解瘢痕疙瘩和正常皮肤中成纤维细胞的数量。通过三种体外组织培养方法分别培养瘢痕疙瘩及正常皮肤,确定成纤维细胞最快捷的培养途径。2.检测瘢痕疙瘩和正常皮肤培养出的成纤维细胞中TRAF6表达的差异性。3.研究NF-κB中的TRAF6抑制后,瘢痕疙瘩和正常皮肤来源成纤维细胞的生长情况。研究TRAF6与瘢痕疙瘩形成的相关性。4.构建TRAF6的真核质粒,为增加成纤维细胞内TRAF6的表达做准备。研究方法1.取人正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织标本制作石蜡切片,采用HE染色技术染色后,在高倍镜视野下观察切片,计数成纤维细胞的数量。比较成纤维细胞在正常皮肤及瘢痕疙瘩中表达的差异。2.应用组织贴壁培养法、胰酶消化法、I型胶原酶消化法培养瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞。观察两种组织中原代成纤维细胞分离培养的情况。3.以瘢痕疙瘩和正常皮肤培养出的成纤维细胞为研究对象,将两者培养至第6代,以不加脂多糖(LPS)为实验对照组A1、A2,以加入LPS为实验组B1、B2。即瘢痕疙瘩组:A1,B1,正常皮肤组:A2、B2。对照组和实验组均加入0mM/ml、10mM/ml、20mM/ml、30mM/ml浓度的TRAF6蛋白抑制剂,继续培养3天,观察成纤维细胞的生长情况,提取成纤维细胞的总蛋白。通过免疫印迹试验即(Western Blot,WB),检测两者来源的成纤维细胞中TRAF6含量的变化。4.选取质粒PIRES2-EGFP作为载体,提取成纤维细胞的总mRNA,利用反转录的方法获得TRAF6的DNA片段,送公司检测所得DNA片段符合人类TRAF6的外显子序列,选取内切酶NheI和SALI切割质粒,连接酶连接目的片段与质粒构成目的质粒。研究结果1.对人类的正常皮肤及瘢痕疙瘩进行HE染色,结果表明:成纤维细胞核染成蓝紫色,胞质为亮粉色,细胞周围的纤维为粉红色。瘢痕疙瘩与正常皮肤比较成纤维细胞数量较多,排列紊乱,细胞周围纤维增多。2.组织贴壁培养法、胰酶消化法、I型胶原酶消化法培养瘢痕疙瘩和正常皮肤分离原代成纤维细胞。采用胰酶消化法和I型胶原酶消化法,原代成纤维细胞出现时间为5-6天;采用组织贴壁培养法,原代成纤维细胞出现的时间为7-9天。3.瘢痕疙瘩组和正常皮肤组相比较,A1与A2细胞数量继续增加,A1趋势低于A2。B1与B2细胞凋亡数量明显,但无明显差异。WB显示:TRAF6在正常皮肤成纤维细胞和瘢痕疙瘩的成纤维细胞中均有表达。在人类的正常皮肤和瘢痕疙瘩中加入抑制剂,体外瘢痕疙瘩培养的成纤维细胞增殖能力明显降低。4.提取细胞RNA,采用逆转录聚合酶链式反应获得目标DNA,测序正确后,选取真核质粒与目的片段连接为重组质粒,采用凝胶电泳筛选出正确的重组质粒。研究结论1.在瘢痕疙瘩和正常皮肤的原代成纤维细胞分离培养中,胰酶消化法、I型胶原酶消化法、组织贴壁法,三者比较前两者原代成纤维细胞分离、贴壁更早,为5-6天;组织贴壁法原代成纤维细胞分离、贴壁为7-9天。2.NF-κB可能参与成纤维细胞的增殖,LPS刺激后瘢痕疙瘩和正常皮肤组织的成纤维细胞凋亡无差异。加入TRAF6抑制剂时,与正常皮肤组织来源的成纤维细胞相比,瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞增殖更慢。3.获得携带TRAF6片段的重组真核质粒。