血小板过度活化是血栓形成的重要原因之一,而大多数心脑血管疾病如动脉粥样硬化、冠心病等都与血栓形成密切相关。因此抗血小板药的开发与应用是心脑血管疾病预防和治疗的重要手段之一。延胡索是传统的活血化瘀中药,针对其治疗血栓相关疾病的研究越来越受到人们重视。其中脱氢紫堇碱、四氢小檗碱、延胡索甲素、四氢黄连碱和海罂粟碱是延胡索抗血小板聚集的主要活性成分,然而其作用机制尚不明确。另一方面,由于血小板无细胞核并且其所包含的mRNA不被翻译,使得血小板的蛋白质组分析尤其具有实用意义,并可通过分析药物对血小板蛋白质组表达的影响来探究其作用机理。鉴于此,本论文应用所建立的基于双向电泳体系(2-DE)结合质谱(MS)鉴定的血小板差异蛋白质组研究方法探究延胡索活性成分的抗血小板聚集作用机制。论文主要包括四个部分。论文第一部分为文献综述,主要阐述了蛋白质组学在细胞信号通路研究中的应用,包括在肿瘤及肝脏疾病、机体代谢和病原微生物致病机制等方面研究中的应用。然后对延胡索及其活性成分抗血小板聚集研究现状进行了简要综述。论文第二部分为差异蛋白质组分析研究延胡索活性成分抗血小板聚集的作用机制。首先,采用体外抗兔血小板聚集实验测定比较了4个延胡索抗血小板活性成分脱氢紫堇碱、四氢小檗碱、延胡索甲素和四氢黄连碱对凝血酶(THR)、二磷酸腺苷(ADP)和花生四烯酸(AA)对3种诱导剂诱导血小板聚集的抑制率,发现脱氢紫堇碱和四氢小檗碱呈浓度依赖性的抑制血小板聚集,且分别对ADP和THR的作用最强,而延胡索甲素和四氢黄连碱抗血小板聚集作用则较弱。其次,采用2-DE技术分析了4个单体成分对兔血小板蛋白组表达的影响,之后采用MALDI-TOF-MS/MS分析鉴定得到加药组与对应空白组之间共约110个差异蛋白(表达差异在1.8倍以上),为进一步探究药物作用机制提供相关信息。此外,二酰基甘油(DAG)是存在于Gq信号通路中尤为重要的小分子,在血小板活化信号转导途径中行使携带和放大信号的功能。因此,本研究采用酶联免疫吸附(ELISA)实验测定药物对DAG表达的影响,结果显示脱氢紫堇碱能降低活化后血小板细胞内DAG的含量。第三部分对延胡索活性成分抗血小板的作用机制进行了探讨。通过文献查阅等方式对所鉴定差异表达蛋白进行功能分析,发现这些蛋白主要参与细胞骨架结构、物质能量代谢及血小板活化信号传导等,其中血小板活化信号通路相关蛋白与药物作用机制密切相关。因此结合已知血小板活化具体信号传导通路,最终推测脱氢紫堇碱可能通过与ADP受体P2Y1和P2Y12结合发挥作用,且最有可能通过RHO介导的细胞骨架相关通路抑制血小板聚集;四氢小檗碱则可能通过影响PAR1的表达并介导其下游信号传导来调节血小板聚集活性。但延胡索甲素和四氢黄连碱需要进一步研究确认。第四部分是结论与展望。本论文通过差异蛋白质组分析推测得出了延胡索中两个活性单体成分脱氢紫堇碱和四氢小檗碱可能的抗血小板聚集作用信号传导通路,为后续研究中寻找这些活性单体的靶标蛋白和探究延胡索治疗血栓的机理奠定基础。