论文部分内容阅读
目的1．探讨生物素-亲和素桥接法制备LHRHa靶向脂质微泡及多聚赖氨酸静电吸附法制备LHRHa靶向载Survivin-pshRNA脂质微泡造影剂的可行性，并观察其体外寻靶能力。2．明确超声联合LHRHa靶向载Survivin-pshRNA脂质微泡能否有效沉默survivin基因表达并诱导卵巢癌A2780/DDP细胞凋亡。方法1．利用生物素-亲和素桥接方式，通过链霉亲和素的桥接作用将生物素化的微泡与生物素化的靶向配体LHRHa结合，构建出带有特定配体的靶向超声微泡造影剂,通过免疫荧光染色验证LHRHa与生物素化脂质微泡的结合情况；通过多聚赖氨酸静电吸附原理将Survivn-shRNA吸附在自制的靶向脂质超声微泡造影剂上，紫外分光光度计检测基因包封率，倒置显微镜下观察该靶向微泡对人卵巢癌A2780/DDP细胞体外寻靶能力。2．通过MTT法检测质粒量、微泡浓度及超声强度、辐照时间对卵巢癌A2780/DDP细胞生长活性影响，筛选出适宜的实验参数。3．将对数生长期的细胞随机分为7组：对照组、质粒组、质粒+微泡组、质粒+靶向微泡组、质粒+超声组、超声+质粒+微泡组、超声+质粒+靶向微泡组，分别给予相应处理，MTT法检测处理后24、48及72小时细胞生长存活率；流式细胞术检测凋亡率，电镜检测超声+质粒+靶向微泡组A2780/DDP细胞超微结构的改变；荧光定量PCR、Westernblotting分别检测处理后48小时各组Survivin在mRNA及蛋白水平表达情况；Western blotting检测各组凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3表达水平。结果1．制备的LHRHa靶向脂质微泡免疫荧光试验阳性；利用静电吸附法构建的LHRHa靶向载Survivin-pshRNA脂质微泡Survivin-pshRNA包封率（22.0±4.16）%，该靶向微泡可与体外培养的卵巢癌A2780/DDP细胞特异性结合，而非靶向微泡不能与A2780/DDP细胞结合。2．超声联合微泡对卵巢癌A2780/DDP细胞的生长活性有一定抑制作用，且具有超声辐照时间、强度及微泡浓度依赖性；超声强度0.5W/cm2，辐照30s，细胞与微泡比例为10:1，质粒量1.6μg时对细胞的生长抑制较小，是较适宜的基因转染参数。3．各处理因素均可抑制A2780/DDP细胞增殖，且呈时间依赖性，其中靶向微泡+超声+质粒组细胞的增殖抑制明显大于同一时间点的其余各处理组（P＜0.05）；流式细胞仪检测细胞凋亡率发现，各处理因素均可诱导细胞凋亡，其中超声+质粒+靶向微泡组凋亡率高达（28.99±2.70）%，明显高于其他组（P<0.05）；透射电镜见超声+质粒+靶向微泡组细胞出现明显的凋亡形态学改变。与对照组相比，各处理组Survivin mRNA及Survivin蛋白均有不同程度下降，其中以超声+质粒+靶向微泡组Survivin mRNA最明显，其Survivin mRNA及Survivin蛋白表达量分别为0.36±0.036、0.05±0.02，明显低于其他组（P<0.05），而凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9表达量分别为0.70±0.26、2.60±0.21，明显高于其它处理组（P<0.05）。结论1．通过生物素-亲和素桥接法和静电吸附原理能成功制备LHRHa靶向载Survivin-pshRNA脂质微泡，该靶向微泡具备体外寻靶能力,但基因的包封率相对较低。2．超声联合LHRHa靶向微泡介导Survivin-pshRNA转染卵巢癌A2780/DDP细胞，能有效沉默survivin基因在A2780/DDP细胞中表达,并促进A2780/DDP细胞凋亡,其凋亡机制与凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9表达上调有关。