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TNF-α/TNF-R、Fas L/Fas和TRAIL/DR5是介导肝细胞凋亡的三个主要通路,而Fas凋亡通路对于调控肝细胞死亡与再生最为关键。Fas凋亡系统包括Fas L配体和Fas受体。其中,Fas受体包括膜型受体(membrane-bound Fas,m Fas)以及可溶型受体(soluble Fas,s Fas)。m Fas受体诱导凋亡,而s Fas抑制凋亡。乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)可调控肝细胞凋亡。已有的研究表明,HBc作为基因调控蛋白,可下调肝细胞膜凋亡受体DR5的表达,从而抑制TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)诱导的凋亡;HBc还可通过抑制MKK7的磷酸化以促进TNF-α诱导的肝细胞凋亡。但迄今为止,尚不清楚HBc对Fas介导的肝细胞凋亡是否有影响。因此,本研究旨在系统探讨HBc对Fas介导肝细胞凋亡的影响及其机制。本研究第一部分旨在探讨HBc对Fas介导的肝细胞凋亡的影响。在本部分第一章,我们构建HBc表达载体p HBc,以空白载体pc DNA3.1/Hygro(+)及p HBc分别转染Hep G2细胞(p53野生型),建立Hep G2-pc DNA3.1空白对照和表达HBc的Hep G2-p HBc混合克隆细胞株并验证其表达。采用CCK-8和TUNEL的方法,发现了HBc可以降低激动型Fas单克隆抗体anti-Fas CH11对p53野生型Hep G2细胞株的毒性并且抑制anti-Fas CH11介导的Hep G2细胞株的凋亡。这些结果表明:HBc可以抑制Fas/Fas L通路介导的肝细胞凋亡。本部分第二章我们进一步研究p53对HBc抑制Fas介导的肝细胞凋亡的影响。为此分别选择了Huh7(p53突变)和Hep3B(p53缺失)的两株肝癌细胞株,通过hygromycin分别筛选了Huh7-p HBc,Hep3B-p HBc混合克隆细胞株并验证了HBc的表达(对照株分别为Huh7-pc DNA3.1及Hep3B-pc DNA3.1)。CCK-8和TUNEL实验表明anti-Fas CH11处理没有对Huh7和Hep3B混合克隆细胞株产生毒性和凋亡效应,并且HBc组和对照组无显著性差异。另外,在anti-Fas CH11处理之前,分别使用p53抑制剂PFT-α以及p53诱导剂Bleomycin处理Hep G2-p HBc和Hep G2-pc DNA3.1,结果显示PFT-α处理导致Hep G2-p HBc和Hep G2-pc DNA3.1凋亡率极低并且无显著性差异,而Bleomycin处理导致Hep G2细胞株整体凋亡率增加并且Hep G2-pc DNA3.1凋亡率高于Hep G2-p HBc。以上结果说明HBc抑制Fas介导的肝细胞的凋亡具有p53依赖性。本研究第二部分旨在探讨HBc对p53,总Fas,m Fas(膜型Fas)以及Fas L转录和表达的影响。为此,采用Real-time RT-PCR和Western blot检测Hep G2-p HBc和Hep G2-pc DNA3.1细胞株中p53,总Fas,m Fas以及Fas L的m RNA和蛋白水平的差异。我们发现Bleomycin可以上调p53和m Fas的m RNA和蛋白水平,而Hep G2-p HBc组p53和m Fas的m RNA和蛋白水平低于对照组。Bleomycin可以上调总Fas和Fas L的m RNA水平,而Hep G2-p HBc组总Fas和Fas L的m RNA水平低于对照组。以上结果表明:HBc可以下调Fas L和总Fas的转录,并且下调p53和m Fas的m RNA和蛋白水平。本研究第三部分旨在探讨HBc对s Fas(可溶性Fas)转录和表达的影响。在本部分第一章,采用Semi-quantitative RT-PCR和ELISA检测Hep G2-p HBc和Hep G2-pc DNA3.1细胞s Fas的m RNA和蛋白水平的差异,发现Hep G2-p HBc组s Fas的m RNA和蛋白水平高于对照组。Bleomycin也可增加s Fas的m RNA和蛋白水平。另外,Fas剪接实验提示:Hep G2-p HBc组的Fas exon5/7(代表s Fas)高于对照组,Bleomycin降低Fas exon5/7水平。以上结果表明:HBc可以上调s Fas的m RNA和蛋白水平。本部分第二章,进一步探讨HBc上调s Fas基因转录及表达的机制,即Fas选择性剪接的机制。为此,采用Real-time RT-PCR和Western blot检测Hep G2-p HBc和Hep G2-pc DNA3.1细胞株中PTBP1、PTBP2、PTBP3、FASTK及TIA-1、TIAR的m RNA和蛋白水平的变化,采用Western blot检测procaspase-3和active caspase-3蛋白水平的变化,采用caspase-3活性实验检测caspase-3的活性。结果发现Hep G2-p HBc组的PTBP1蛋白水平高于对照组,但PTBP2和PTBP3的蛋白水平和对照组相比无变化,Hep G2-p HBc组PTBP1,PTBP2和PTBP3的转录和对照组相比无明显变化。Hep G2-p HBc组active caspase-3活性低于对照组。Hep G2-p HBc组FASTK启动子活性、基因转录及表达低于对照组,而TIA-1、TIAR基因的转录和表达和对照组相比无变化。以上结果说明:HBc通过上调PTBP1促进对Fas的选择性剪接,并通过下调FASTK水平抑制TIA-1和TIAR对Fas的选择性剪接。