[研究背景和目的]胆囊结石是消化系统常见病,其发病率逐年上升。胆囊结石分为胆固醇结石(cholesterol gallstone, CG)及胆色素结石,其中70%为CG。胆囊动力障碍、胆汁淤积是胆囊结石特别是CG的重要成因,也是保胆治疗术后结石复发的重要原因。Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal, ICC)是胃肠起搏细胞,其数量结构或功能异常与许多胃肠疾病密切相关；ICC的特异标志为酪氨酸激酶受体c-Kit,被广泛用于鉴定ICC及其功能研究。近年来,随着人胆囊及胆道ICC的发现,ICC在胆囊及胆道中所起的作用倍受关注。2013年,有研究报道,胆囊结石患者胆囊壁ICC显著减少,提示ICC损害可能参与了胆囊结石的发生过程。但胆囊壁ICC损害是否介导了胆囊动力障碍而参与胆囊结石形成?其机制鲜有报道。胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)是胆囊收缩的主要激素,血清CCK浓度降低、胆囊CCK1受体(Type 1 cholecystokinin receptor, CCK1)表达减少与胆囊动力障碍、结石形成密切相关。近年研究表明,ICC可能是CCK的重要靶细胞：有研究报道,大鼠胃幽门ICC及豚鼠的胆囊ICC均表达CCK1。因此本研究通过：①临床胆囊标本：探讨胆囊ICC损害与胆囊动力障碍有无相关性,同时研究ICC减少是否可引起CCK1减少；②动物模型：探讨胆囊ICC损害在胆囊动力障碍、结石形成中的作用,及长期高胆固醇饮食对胆囊ICC的影响；③细胞实验：高浓度胆固醇对ICC生长的作用,以期阐明CG患者胆囊ICC损害的机制。[方法]1、临床标本：CG患者胆囊ICC损害与胆囊动力障碍的相关性实验组：CG胆囊切除患者,对照组：早期胰头癌或肝右叶肝癌未累积胆囊而行胆囊切除患者。胆囊切除后,取部分胆囊体部组织及胆汁,进行以下实验：(1)免疫荧光双标,鉴定人胆囊ICC上是否存在CCK1；(2)制备离体胆囊平滑肌肌条、记录胆囊肌条的收缩功能；(3)免疫组化标记c-Kit+细胞,免疫荧光双标技术标记ICC,计算c-Kit+细胞及ICC密度；将c-Kit+细胞密度、ICC密度分别与胆囊肌条收缩功能进行相关性分析；(4)免疫荧光双标,标记CCK1及c-Kit,观察CCK1表达与c-Kit表达间的关系；(5)HE染色,测量胆囊粘膜层+肌层厚度；Western检测c-Kit蛋白表达；(6)检测胆汁胆固醇浓度。2、动物模型：胆囊ICC损害在胆囊动力障碍、CG形成中的作用(1)按照文献,建立CG豚鼠模型：4周龄豚鼠40只,随机分配至“普通饲料组(Regular diet, RD)"及“致石饲料组(lithogenic diet, LD)";(2)B超监测成石情况,喂养6周处死豚鼠,观察胆囊大体标本情况；(3)检测豚鼠胆囊肌条的收缩功能;(4) real-time PCR检测c-Kit、CCK1 mRNA表达；对胆囊肌条收缩功能及c-Kit mRNA表达水平进行相关性分析。3、细胞实验： CG胆囊ICC损害的机制——高浓度胆固醇对ICC生长的影响(1)酶解法分离小鼠胆囊细胞,标记以下抗体：PE-Cy7(PC7)标记的抗c-Kit、PC5标记的抗CD45、PC5标记的抗F4/80、PC5标记的抗CD11b、PE标记的抗CD34抗体,流式细胞仪分选出c-Kit+CD45-F4/80-CD11b-CD34-的细胞(即具有成熟ICC标志的细胞)；将分选出的细胞接种至鼠尾胶原包被的培养皿中、含高浓度血清(15%胎牛血清)的M199培养基进行培养；(2) Real-time PCR鉴定分选效率、免疫荧光鉴定ICC；(3)细胞分组：对照组、实验组(给予不同浓度的水溶性胆固醇(water-soluble cholesterol,WSC));培养72h,real-time PCR检测c-Kit mRNA水平。[结果]1、临床标本研究：CG胆囊ICC损害与胆囊动力障碍的相关性(1)对照组(n=10例),CG组(n=30例)。两组患者平均年龄与男女性别构成比均无统计学差异(2)人胆囊ICC上存在CCK1表达(3)CG组离体胆囊肌条收缩能力较对照组明显减弱(4)CG组胆囊壁c-Kit+细胞密度及ICC密度均较对照组显著降低；c-Kit+密度/ICC密度与胆囊肌条收缩能力呈正相关(5)CCK1表达与c-Kit表达变化一致(6)CG组胆囊壁厚度较对照组增厚,胆囊c-Kit蛋白表达较对照组降低(7)CG组胆汁胆固醇浓度较对照组升高2.动物模型研究：胆囊ICC损害在胆囊动力障碍、CG形成中的作用(1)RD组豚鼠均未形成胆囊结石,LD组豚鼠成石率为60%(2)LD组(形成结石及未形成结石的)其离体胆囊肌条收缩能力均较RD组减弱(3)LD组豚鼠胆囊c-Kit、CCK1 mRNA表达较RD组明显降低(4)胆囊c-Kit mRNA表达水平与胆囊肌条收缩能力呈正相关3、细胞实验：CG胆囊壁ICC损害机制——高浓度胆固醇对ICC生长的影响(1)流式细胞术分选ICC：具有成熟ICC标志的细胞占全部酶解法分离出的小鼠胆囊细胞的10.32±2.21%(2)ICC的培养与鉴定：培养12小时后,可见细胞贴壁；c-Kit及ANO1 (ICC另一特异标志)免疫荧光染色显示：细胞c-Kit、ANO1表达均为阳性,c-Kit标记时细胞胞质着色,ANO1标记时胞质及胞核均着色。收集分选前及分选后的ICC进行real-time PCR检测分选效率,结果提示：分选后的c-Kit mRNA与GAPDH mRNA的比率较分选前提高102±3.18倍(3)外源性WSC干预：加入10mM、20mmM、40mM的WSC作用72h后,与对照组相比,ICC数量显著减少,c-Kit mRNA表达水平显著降低(P<0.05)[结论]1、临床标本(CG患者及对照组胆囊、胆汁标本)的研究提示：①人胆囊ICC存在CCK1表达,CCK通过作用于ICC表面的CCK1使胆囊收缩；②胆囊壁ICC损害可致CCK1表达减少,CCK对胆囊收缩作用减弱,进而引起胆囊动力障碍；③CG患者胆汁中胆固醇浓度较对照组增高。2.动物实验(胆囊胆固醇结石豚鼠模型)的研究提示：长期高胆固醇摄入可致胆囊ICC减少、胆囊动力障碍、进而促进胆固醇结石的形成；在结石形成前,即发生胆囊动力减弱。3.细胞研究提示：高浓度胆固醇可显著抑制ICC的生长,CG患者胆囊的ICC损害可能由于长期的高浓度胆固醇胆汁所致。一、研究背景和目的ICC是胃肠起搏细胞,产生慢波并传导电兴奋,ICC起搏功能的产生与胞内Ca2+振荡有关。CCK是一种双重分布在胃肠道及中枢神经系统中的脑肠肽,通过其受体对胃肠运动、胆囊收缩和胰酶分泌等起重要调节作用。既往研究发现大鼠胃幽门ICC上存在CCK1,提示CCK可能直接作用于ICC。本研究首先通过小鼠胃窦组织全层铺片及切片的c-Kit与CCK1免疫荧光共同标记,来证明小鼠胃窦ICC存在CCK1；其次通过分离并培养小鼠胃窦ICC,观察CCK对ICC胞内钙振荡的影响,并探讨具体的分子机制。二、方法1、对小鼠胃窦组织全层铺片、切片及体外培养ICC进行c-Kit与CCK1免疫荧光双标2、CCK对ICC胞内钙离子振荡影响的检测：(1)酶法分离、流式分选、培养并鉴定小鼠胃窦ICC;(2) Fluo-3/AM负载ICC,激光共聚焦显微镜下观察CCK、CCK1受体拮抗剂氯戊米特、内质网钙泵拮抗剂毒胡萝卜素、1,4,5-三磷酸肌醇受体(1,4,5-triphosphate, InsP3R)拮抗剂Xestospongin C及L-型Ca2+通道阻滞剂硝苯地平等对ICC胞内钙振荡的影响。三、结果1、小鼠胃窦组织、体外培养ICC存在c-Kit与CCK1共定位,免疫荧光鉴定培养的细胞为ICC;2、CCK对ICC胞内钙离子振荡影响的检测：CCK可显著升高ICC胞内钙离子浓度(intracellular calcium concentration,[Ca2+]i),该效应可分别被氯戊米特、毒胡萝卜素、Xestospongin C所拮抗,给予硝苯地平也可稍减弱CCK的作用。四、结论CCK通过作用于ICC表面上CCK1受体促进其内质网上InsP3R介导的内钙释放,导致ICC胞内[Ca2+]i显著升高。