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几丁质酶在真菌和昆虫的生理和发育过程中起着关键作用,该酶本身及其酶抑制剂是获取生物农药的重要途径。
论文首先分别从蚕蛹和棉铃虫蛹体内提取几丁质粗酶,经过硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-150分离得到几丁质酶。用SDS-PAGE测得两酶的分子量分别为88kDa、75kDa;水解胶体几丁质的Km值分别为22.3μmol/L、41.0μmol/L;酶反应的最适温度分别为45℃和50℃,最适pH值均为6.0;高浓度的Mn2+对两酶均有较强的激活作用,而Cu2+、SDS对两酶都有较强的抑制作用;两酶对所选用的真菌均有抑制作用。
以棉铃虫蛹几丁质酶作为筛选靶标,通过平板透明圈法和DNS比色法进行几丁质酶抑制剂的筛选,从全国各地共34份土样中筛选出以A0901#菌株为代表的具有几丁质酶抑制性的活性菌株33株。
对33株活性菌株发酵液中的活性物质成分的分离纯化技术进行初步探索,比较系统地研究了A0901#菌株活性物质的分离纯化。采用活性追踪的方法对其进行分离,通过乙醇沉淀、Sevage试剂除蛋白及Sephadex G-100凝胶色谱得到一个纯的活性物质,经HPLC检测显示在保留时间15min左右为一单峰,DNS比色法验证其抑制率为54.2%,红外、质谱、元素分析确定其为一个多羟基的化合物。
经形态、培养特征以及16S rDNA序列聚类分析,将菌株A0901#鉴定为链霉菌属。并确定其发酵条件为:可溶性淀粉作为碳源,KNO3作为氮源,发酵培养基初始pH值调至6.0,最适温度28℃,接种量为10%,培养时间6d,发酵液抑制效果最佳。