胞膜窖(caveolae)是细胞质膜表面直径为50~100nm的烧瓶状内陷微区。作为质膜上的独立结构,胞膜窖参与多种细胞活动,如胆固醇转运、细胞内吞(endocytosis)、细胞膜组装、信号转导、肿瘤生成等。窖蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)是组成胞膜窖的主要功能蛋白,它与窖蛋白-2形成稳定的异源寡聚体,在内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和脂肪细胞等分化细胞中含量丰富。肝脏是人体代谢的中心站,含有极其丰富的磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC)。在哺乳动物肝脏中,除了CDP-胆碱通路(Kennedy通路)外,还存在一条特有的PC合成通路,即磷脂酰乙醇胺N一甲基转移酶(phosphatidylethanolamine N-methyltransferase, PEMT)催化磷脂酰乙醇胺甲基化生成PC的PEMT通路。研究发现,肝病时合成PC的PEMT活性降低。本实验室曾在大鼠肝癌细胞CBRH-7919中过表达PEMT2,发现其生长被显著抑制,并被诱发细胞凋亡。提示,肝脏中脂质代谢与肝细胞增殖的调控密切相关。事实上,窖蛋白-1对细胞增殖和脂肪形成都具有调节作用。一方面,在包括乳腺癌在内的多种癌细胞内,Cav-1表达下调;窖蛋白-1可以通过其N端的脚手架区(caveolin scaffolding domain, CSD)寡聚Erk1/2的上游蛋白,抑制Erk1/2的活化,从而抑制细胞增殖和肿瘤转移。因此,窖蛋白-1通常被认为是候选的肿瘤抑制基因。但在个别癌症如膀胱癌、食道癌、甲状腺癌及前列腺癌中,Cav-1表达上调,提示Cav-1可能在这些癌症中起促肿瘤生成作用。另一方面,甘油三酯为肝再生提供能量并为新生细胞膜形成提供不饱和脂肪酸,甘油三酯的聚集是肝再生活动中的重要事件。最新的研究表明,窖蛋白-1通过促进甘油三酯的储存和利用而对肝再生起重要的调控作用。因此可以说,窖蛋白-1同时具有抑制细胞增殖和促进肝再生的双重作用,但目前Cav-1在正常肝细胞增殖和转化中的作用及机制尚不十分清楚。为探讨窖蛋白-1对正常肝实质细胞增殖所起的作用,本文构建了窖蛋白-1特异性的短发夹RNA表达载体psiRNA-CAV3、psiRNA-CAV6和psiRNA-CAV7;其中,psiRNA-CAV7被转染至人张氏肝细胞系,并使用抗生素Zeocin筛选,得到Cav-1表达稳定下调的细胞株CAV7,而载体psiRNA-CAV3和psiRNA-CAV6做瞬时转染。MTT法检测CAV7细胞增殖的变化,Western Blot检测Erk1/2和Akt等增殖生长相关信号蛋白表达和活性的变化。探讨体外下调张氏肝细胞内窖蛋白-1的表达对人肝细胞增殖的影响,以及产生影响的可能分子机制。同时,本文还检测大鼠肝再生过程细胞内Cav-1及Erk1/2表达的变化,试图探讨窖蛋白-1在肝再生中所起作用及可能的信号转导机制。实验得到的结果包括:(1)正常张氏肝细胞有高水平的Cav-1表达,稳定转染psiRNA-CAV1后,Cav-1表达减少约70%;Cav-1表达下调后,肝细胞的增殖先变快(24和72小时, P<0.05; 96小时, P<0.01),后减慢。(2) CAV7细胞内Cav-1下调后肝细胞内Akt和Erk1/2蛋白的激活受到抑制,细胞的增殖可能因此减慢。(3)瞬时转染的CAV3和CAV6细胞至120小时Cav-1表达下调后,Erk1/2蛋白被激活,提示Cav-1对Ras-Erk1/2通路具有抑制作用。(4)无论瞬时还是稳定转染组,Cav-1下调后肝细胞内SAPK/JNK蛋白活性始终受抑制,而c-myc表达持续升高。(5)肝再生过程中,细胞内caveolin-1的表达在肝切除手术后24小时达到最高,并在96小时仍维持一定的高水平,提示其在肝再生中可能发挥作用;同时,Erk1/2的表达增加,并在术后96小时达到最高。综合已有的研究,本文得到以下结论:(1)窖蛋白-1可能通过参与跨膜信号转导影响Akt、Erk、JNK、c-myc等多个相关信号分子活性,从而调控正常肝实质细胞增殖。(2)窖蛋白-1可能通过调控肝细胞内甘油三酯代谢而在肝再生中起重要作用。