研究背景肩袖损伤后,其腱骨愈合受到多方面因素的影响,包括机械应力、炎症反应和细胞因子等很多方面,腱骨界面(bone-tendonjunction, BTJ)常常被认为是关节损伤修复早期的薄弱点。临床资料显示,外科手术修补后的肩袖以瘢痕重塑的形式愈合,由多种炎症因子和生长因子参与修复重建过程。这种非完全重建式的愈合使得肩袖组织的生物力学强度远远低于正常水平,最终结果往往导致术后肩袖再撕裂的发生。TGF-β1是促使BTJ愈合中瘢痕形成的关键因子,前人研究发现,通过抑制TGF-β 1/Smad信号通路可以抑制瘢痕增生。在此基础上,本研究拟构建SD大鼠冈上肌BTJ损伤的修复模型,在体研究TGF-β1及Smad在其愈合过程中的分布与瘢痕形成的相关性；分别在愈合与重塑的不同时期,用针对沉默TGF-β1、Smad蛋白家族设计的慢病毒感染BTJ,抑制TGF-β1/Smad信号通路,观察抑制后的BTJ细胞和细胞外基质的变化及相关生物学、生物力学的改变,探究此信号通路对肩袖BTJ愈合的调节机制,为临床治疗提供新思路。研究目的本课题拟通过构建SD大鼠单侧冈上肌损伤修复模型,在体研究TGF-β1及Smad在其愈合过程中的分布与瘢痕形成的相关性；分别在愈合与重塑的不同时期,用针对沉默TGF-β1、Smad蛋白家族表达的慢病毒感染BTJ,抑制TGF-β1/Smad信号通路,观察抑制后的BTJ细胞和细胞外基质的变化及相关生物学、生物力学的改变,探究此信号通路对肩袖BTJ愈合的调节机制。研究方法1、实验设计选取雄性SD大鼠50只(第二军医大学动物实验中心提供),体重(150-200)g,其中10只不做手术处理作为①空白对照组。剩余40只模拟行单侧(左上肢)冈上肌肩袖组织撕裂修补术,术后平均分为4组,在术后3d、5d、10d在冈上肌肩袖局部分别给予不同药物注射处理,根据注射药物的不同分为②生理盐水对照组、③TGF β1抑制组、④Smad2抑制组、⑤TGF β1/Smad2共同抑制组,药物注射治疗后分别在第7d、14d、21d、28d各处死2只SD大鼠,留取左上肢冈上肌局部标本,进行生物力学检测和组织学、免疫组化观察,评估肩袖愈合效果。2、模型制备的手术方法：SD大鼠采用10%水合氯醛生理盐水溶液(按照体重标准0.4ml/500g)腹腔注射麻醉,麻醉完成后,在固鼠板上用皮筋固定大鼠四肢(俯卧位固定),用剃毛器刮净左上肢局部毛发,用1%医用碘伏消毒备皮区,铺无菌单。纵行切开皮肤,长约3-4cm,分离浅筋膜至暴露肩胛区及上臂肌肉,找到斜方肌附着部,沿斜方肌境界轻柔切开此肌肉,向前上方翻开即可见冈上肌正位于斜方肌覆盖之下。仔细分离整条冈上肌至肱骨大结节止点,切断少许三角肌充分暴露冈上肌在肱骨大结节的附着部位,钝性撕脱冈上肌在肱骨大结节处的附着,用巾钳在肱骨大结节上建立骨隧道,方向与冈上肌在骨质表面的附着走形一致,再用不可吸收缝线分别在冈上肌组织末端间隔1.5-2mm缝合组织,并将缝线穿过骨道打结固定,将冈上肌腱缝合在原来的足印区,建立SD大鼠单侧冈上肌损伤修复模型备用。3、分阶段抑制TGFβ1/Smad信号通路1)针对TGFβ1Smad2的siRNA的设计、合成和筛选根据siRNA设计原理和要求,针对SD大鼠TGFβ1、Smad2基因序列特征,为每个基因分别设计合成三对荧光报告基因标记siRNA;脂质体包裹siRNA,以相同浓度,相同作用时间转染SD大鼠成纤维细胞;Rt-PCR, Western Blot筛选高效特异的siRNA;确定最佳转染浓度和时间。2) TGFβ1、Smad2的慢病毒感染效果及评价根据siRNA的位点序列合成相应的shRNA质粒,并包装出相应的慢病毒,感染大鼠成纤维细胞验证其对靶基因的抑制效率3)分阶段抑制注射在BTJ愈合和重塑的不同阶段,注射慢病毒抑制TGF β 1/Smad通路,术后3d、5d、10d连续给药3次,注射慢病毒感染大鼠单侧(左上肢)BTJ部位。4、取材及制作标本：药物注射治疗后每组分别在第7d、14d、21d、28d各处死2只SD大鼠,留取左上肢冈上肌局部标本,进行生物力学检测和组织学、免疫组化观察,评估肩袖愈合效果；切取肩胛骨及与其相连的肱骨为一个完整部位行生物力学抗拉力测试,同时取1只正常组大鼠的左侧BTJ样本为对照。生物力学测试完成后的标本,取大结节足印区的组织(厚约5mm)进行脱钙固定留备,染色、免疫组化检测,比较愈合过程不同时间BTJ中瘢痕组织的形成和转归的特点,以及纤维软骨的分布及其与正常BTJ的差别。5、观察方法和结果测定：生存状态观察：首先在取材之前对于不同实验组的SD大鼠,比较其在术前、术后不同时间节点的生存状态,比如动物活动状态、手术切口愈合情况(有无感染等炎症反应)、肢体活动度等等。HE染色观察：组织经过固定、脱钙、脱水、清洗、包埋、切片和染色,可见细胞核呈蓝色,细胞质呈淡红色。Masson三色法染色观察：胶原纤维呈蓝色,肌纤维、细胞质、纤维素、角蛋白和红细胞呈红色,细胞核呈蓝褐色。6、统计学分析：各组动物之间在各时间点的生物力学数据统计学分析采用SNK-q检验(Student-Newman-Keuls test),以明确各组之间各个时间节点的腱骨愈合是否存在差异。研究结果1、大体结果手术组与非手术组对比：手术组动物在术后出现活动度减退,肢体活动度受限的情况,影响大鼠行走步态(跛行或者拖行),部分出现伤口崩裂、局部组织感染化脓(感染率为20%)；饮食无明显变化；手术组动物易激惹。接受手术的动物,不同给药治疗组之间的比较：大鼠生存状态无明显异常,感染率无明显差别(20%)。2、组织切片染色结果1)手术组动物(②③④⑤)肩袖BTJ最终达到瘢痕愈合；局部瘢痕生成的量有所不同；2)⑤组动物最终愈合结果的瘢痕与②③④组比较明显减少,愈合效果最好,肉眼观察有差异；②③④组间结果比较,在肉眼下观察无明显差异,BTJ处有较多的瘢痕组织及杂乱的新生胶原纤维；3)成纤维细胞含量：①空白对照组45%；②生理盐水对照组78%；③TGF-β1抑制组70%;④Smad2抑制组75%；⑤TGF-β1/Smad2共抑制组50%。3、免疫荧光、Rt-PCR、Western Blot检测结果1)细胞基质成分中Aggrecan、Biglycan、Elastin、Tenascin-C的含量在③④⑤组均有升高,⑤组升高最明显；2)基质酶的改变中,MMP在③④⑤组均呈降低趋势,在第②组呈增高趋势,TIMP的变化趋势与MMP相反；3)COX酶含量的化各不相同,各组之间无可比性；4)转录因子SOX9的含量与第①组相比在②③④⑤组呈增高趋势,各组之间无明显差异；5)凋亡相关因子p53,NF-κB,热休克蛋白的变化③④⑤组总体呈降低趋势,⑤组最明显；而第②组结果与其他相反,呈上升趋势,提示有组织退变的可能。4、生物力学检测结果肩袖愈合的总体趋势随着时间的推移体现为腱骨愈合部位的终末拉力值的增强,其中,第⑤组的终末抗拉力结果优势最明显。同一时间节点,各分组生物力学数据样本均数两两之间的全面比较比较采用SNK-q检验(Student-Newman-Keuls test),按照α=0.05水准：第⑤组与②③④组在各时间节点数据比较均有统计学意义,P<0.05；第①组与②③④组在前3周数据比较有统计学意义,最后一周数据之间无统计学意义,P>0.05；第①组与第⑤组之间在最后一周数据相比有统计学意义,P<0.05,前三周数据相比无明显统计学意义,P>0.05；②③④三组之间各时间节点数据比较,无明显统计学差异,P>0.05。研究结论单侧SD大鼠冈上肌损伤修复模型具有易操作、成功率高、可重复性好、模型动物生存质量稳定、取材方便等方面的优点,是研究肩袖病变发病机制的良好模型；HE染色是组织切片常用的染色方法,操作简便,可以大体观察到BTJ的组织层次,初步评价愈合效果；Masson染色可以特异性的观察胶原纤维的分布,有助于评价肩袖愈合的效果；免疫组化、Rt-PCR和Western Blot对于生长因子,蛋白、酶类以及信号通路上的其他物质的变化可以检测的更为精确,发现信号通路抑制后愈合过程中物质含量的变化,为进一步揭示其作用机制提供了依据。研究表明,抑制TGF-β1/Smad信号通路可以改善BTJ的瘢痕愈合状况,促进肩袖愈合过程中的合成代谢过程,降低肩袖疾病进一步恶化的风险,但详细的作用机制有待进一步深入研究。TGF-β1/Smad共抑制组所表现的愈合结果较单方面抑制两者其中之一的效果好,愈合区域瘢痕组织产生较少。本研究有助于为临床治疗肩袖疾病(RCD)提供新的思路。