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目的:我们之前的研究发现,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate,NADPH)通过抑制氧化应激和自噬而显著保护神经元免受兴奋性毒性损伤。研究证明,NADPH既可以作为辅酶产生还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH),也可以作为 NADPH 氧化酶(NADPH oxidase,NOX)的底物产生活性氧。本研究旨在阐明NADPH和NOX抑制剂二苯基氯化碘盐(Diphenyleneiodonium,DPI)对红藻氨酸(Kainic acid,KA)诱导的兴奋性毒性的影响及其机制。方法:采用立体定位注射的方式,在成年ICR小鼠体内构建单侧纹状体注射KA的兴奋性毒性模型。在单次注射KA前30min尾静脉注射NADPH,模型构造后立刻腹腔注射NOX抑制剂DPI,在之后的一周中每天给予NADPH和DPI一次。采用Nissl染色法评价纹状体损伤面积和神经元存活状态。通过转栅试验、脱粘试验、圆缸试验及其组合评分,评价神经功能缺陷导致的行为学异常。通过总超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase,T-SOD)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒测试 SOD活性和MDA浓度,以评价氧化应激水平。差速离心法分离纹状体组织的线粒体组分、细胞核组分和细胞浆组分,Western blot检测总蛋白中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-I、P62,以及 Tp53 诱导糖酵解和凋亡调节因子(Tp53 induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)和NOX4蛋白表达水平的变化;细胞核组分和细胞浆中氧化应激相关蛋白核呼吸因子2(Nuclear respiration factor 2,Nrf2)蛋白表达水平;线粒体组分和细胞浆组分中线粒体自噬相关蛋白PINK1和COXⅣ蛋白表达水平。结果:本实验成功建立了 ICR小鼠兴奋性毒性的体内模型。Nissl染色结果显示,KA模型组的纹状体神经元皱缩,与对照组相比,形态正常的神经元数目显著减少。SOD和MDA结果显示,与对照组相比,KA模型组的SOD活性显著降低,脂质过氧化物MDA水平明显增加。Western blot结果显示,与正常对照组相比,KA模型组P62和TIGAR蛋白表达水平降低、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和NOX4蛋白表达水平增加;Nrf2核转位增加;线粒体组分中PINK1蛋白表达水平增加。NADPH和DPI单独使用均能减少KA介导的纹状体神经元受损。NADPH逆转了 KA介导的P62和TIGAR蛋白表达减少、NOX4表达增加;DPI也能抑制KA介导的P62和TIGAR蛋白表达水平下降。与任一单用组相比,小剂量的NADPH和NOX抑制剂DPI联合使用对KA介导的神经保护作用都更为显著,表现为纹状体正常形态神经元数目明显增多。神经功能缺陷导致的失常行为学评价实验结果显示,与单用组相比,NADPH和DPI联用使用具有更好的肌肉张力、精细运动能力、肢体协调性和神经功能障碍评分。结论:NADPH和DPI可能通过抑制自噬途径改善KA导致的神经元损伤。在KA介导的兴奋性毒性中,NADPH和NOX抑制剂DPI联合使用,可能通过减少NADPH作为NOX底物生成ROS,从而具有更好的神经保护作用。