论文部分内容阅读
研究背景肝癌是常见恶性肿瘤。2019年1月,国家癌症中心发布最新一期统计数据显示,原发性肝癌位于我国恶性肿瘤发病谱第四位,而病死率却居全国第二位。与全球恶性肿瘤新发病例和死亡病例比较,我国肝癌等消化道肿瘤占到全球一半。随着现代医学科学技术的发展,肝癌治疗取得了很大进步。但因肝癌早期临床症状不显著,70%~80%病人就诊时病情已为进展阶段。目前,以外科手术、肝动脉栓塞化疗、放疗以及联合多种治疗手段的综合治疗是我国专家推荐的治疗方案。因此,若能抑制肝癌细胞增殖和转移,将显著提高肿瘤治疗效果,改善病人预后。全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)于上世纪八十年代已被我国科学家用于急性早幼粒白血病的治疗,取得了很好疗效,在九十年代被誉为国际抗癌药物三大发现之一,备受国内外专家关注。而ATRA在用于肝癌治疗时发现,要产生疗效,需要的药物浓度是白血病治疗的十倍。如此高的用药浓度不适合临床应用,其原因是高剂量ATRA的应用可引起维甲酸综合症。寻找低毒高效的维甲酸衍生物显得尤为重要。在ATRA基础上人工加上一个酰胺基团而成N-(4-羟基苯基)维生素甲酰胺(fenretinide)为乳腺癌化学预防的药物,其副作用较小。早期研究显示它具有预防和治疗肿瘤、促进肿瘤细胞凋亡的作用,近些年研究显示其具有预防肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移的效应。本文着重研究fenretinide对肝癌细胞增殖、迁移的影响。肿瘤的转移与其运动性增强有密切关联,肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)的表达增加和激活是细胞运动的重要因素。Fenretinide抑制肿瘤细胞迁移的作用机制与降低细胞运动性是否有关?尚不明确。目前,fenretinide抑制肝癌细胞迁移及其相关机制报道较少。本课题探讨fenretinide对肝癌Hep G2和SMMC-7721细胞生物学行为的影响,是否能降低肝癌细胞的迁移,以及这种作用是否与MLCK有关,并通过动物体内实验进一步论证它的有效性和相关机制。为fenretinide更好的用于肝癌的临床治疗奠定理论基础。目的体外研究fenretinide对肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721增殖、平板克隆形成和迁移能力的影响,体内研究fenretinide对肝癌细胞系SMMC-7721成瘤影响,并初步探讨其作用机制。方法用不同浓度的fenretinide和前身药物ATRA分别处理肝癌Hep G2和SMMC-7721细胞,MTS法检测药物刺激后细胞的增殖能力;平板克隆实验检测药物作用后Hep G2和SMMC-7721细胞体外克隆形成能力;细胞划痕实验检测两种药物对Hep G2和SMMC-7721细胞迁移能力的影响。为进一步研究fenretinide和ATRA影响Hep G2、SMMC-7721细胞迁移的作用机制,Western blot检测MLCK、p38-MAPK信号通路蛋白、迁移相关蛋白等的表达。Hep G2和SMMC-7721细胞中分别和组合加入fenretinide、ATRA、SB203580、ML-7,以细胞划痕检测细胞迁移变化,Western blot检测相关蛋白表达变化。采用SMMC-7721细胞皮下移植裸小鼠获得肝癌移植瘤模型,用药后定期监测肿瘤体积和小鼠体重,观察药物对移植瘤增长的抑制作用,HE染色观察对移植瘤病理形态的影响,Masson染色观察对移植瘤纤维组织分布影响,免疫组化和Western blot检测对移植瘤MLCK、MLC和p38-MAPK磷酸化的影响。结果Fenretinide能抑制Hep G2和SMMC-7721细胞的增殖,在1μM~25μM浓度范围内,fenretinide对Hep G2细胞的生长抑制率为1.32%到95.13%;对SMMC-7721细胞生长抑制率为0.27%到78.36%,作用的量效关系明显。抑制作用的时效关系亦明显,fenretinide 15μM处理Hep G2细胞48 h抑制率接近50%,处理72 h则达到90%;15μM处理SMMC-7721细胞48 h抑制率接近30%,处理72h则达到85%。同时,fenretinide能显著抑制Hep G2和SMMC-7721细胞平板克隆形成和迁移能力。在相同药物浓度作用下,ATRA对细胞增殖、平板克隆和迁移抑制效应均弱于fenretinide。细胞蛋白水平检测显示fenretinide抑制了Hep G2细胞MLCK表达和MLC磷酸化,抑制了SMMC-7721细胞MLC磷酸化;并且改变了迁移相关蛋白E-cadherin和F-actin表达;在信号通路上,fenretinide激活了p38-MAPK通路。加入了p38-MAPK通路的抑制剂,显示SB203580会逆转fenretinide对Hep G2细胞迁移的抑制作用;蛋白水平检测显示,MLC磷酸化增加,迁移相关蛋白E-cadherin表达降低,F-actin表达增加,与fenretinide单独作用效应相反。进一步观察fenretinide是否通过降低MLCK活性减少Hep G2和SMMC-7721细胞的迁移,使用MLCK抑制剂ML-7,发现细胞的迁移能力明显受到抑制,ML-7联合fenretinide细胞迁移能力降低更显著;蛋白水平检测显示,MLC磷酸化降低,p38磷酸化增加,迁移相关蛋白E-cadherin表达增加,F-actin表达减少,与fenretinide单独作用效应相类同。体内裸小鼠移植瘤模型观察到fenretinide显著抑制SMMC-7721细胞移植瘤增殖,抑制能力随药物使用时间延长而加强,用药期间小鼠体重没有显著下降;移植瘤组织镜下可见细胞核排列相对规则,坏死较少见,纤维组织分布增加,MLCK磷酸化减少,p38-MAPK磷酸化增加。结论Fenretinide可以抑制Hep G2细胞和SMMC-7721细胞增殖、克隆形成和迁移能力;与ATRA比较,fenretinide更有效的抑制了Hep G2细胞和SMMC-7721细胞增殖、克隆形成和迁移作用;fenretinide激活p38-MAPK信号通路,改变迁移相关蛋白E-cadherin和F-actin表达,下调MLCK活性从而降低细胞运动性,抑制Hep G2和SMMC-7721细胞的迁移。Fenretinide有效抑制了肝癌移植瘤增殖,改善了肝癌组织形态紊乱状况,增加了纤维组织分布,作用可能与激活p38-MAPK通路,降低MLC磷酸化相关。