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研究背景:支气管哮喘（asthma,AS）是威胁全人类健康的慢性异质性疾病。气道高反应性（airway hyperresponsiveness,AHR）是支气管哮喘的基本特征,表现为对各种刺激物的反应增加,支气管过度收缩,从而引起患者发作性的喘息、气促及呼吸困难等症状。AHR是导致儿童或成人哮喘病情发展的重要危险因素,决定了呼吸道症状的严重程度,肺功能的下降速度以及临床治疗方案的选择。AHR发生机制复杂,主要涉及气道炎症、气道平滑肌（airway smooth muscle,ASM）结构及功能的改变、气道重塑、神经调节等方面,但其机制至今尚未阐明。因此,寻找AHR相关生物标志物,对研究哮喘AHR发病机制具有重要意义。嗜酸粒细胞性支气管炎（eosinophilic bronchitis,EB）是以咳嗽为唯一或主要表现,诱导痰嗜酸性粒细胞（eosinophilic,EOS）明显增高,而肺通气功能和气道反应性正常,糖皮质激素治疗有效的一类疾病。由于EB和哮喘具有相似的气道炎症,仅存在无气道高反应性的特点使其成为研究支气管哮喘气道高反应机制的良好参照。蛋白组学研究能对蛋白质进行精确定量,可用于差异表达蛋白（differentially expressed proteins,DEPs）的筛选和机制研究。在前期研究中,我们使用卵清蛋白（ovalbumin,OVA）成功构建了小鼠EB模型,并获取小鼠肺组织标本,首次应用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）和等重同位素标记相对和绝对定量技术（isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ）对生理盐水（normal saline,NS）、AS、EB组小鼠肺组织进行蛋白定量、蛋白注释、聚类、功能富集和蛋白质相互作用分析,通过分析NS、AS、EB组蛋白组学特征和查阅相关文献,筛选出AHR相关蛋白S100a8,为下一步研究哮喘AHR发病机制奠定基础。S100a8作为S100钙结合蛋白家族的重要成员,其强大的Ca2+结合能力使其能与多种蛋白相互作用,从而调节细胞收缩。在平滑肌细胞中,肌球蛋白交叉桥循环是收缩的主要机制,肌球蛋白的激活受肌球蛋白轻链（myosin light chain,MLC）磷酸化调节。细胞内Ca2+可激活肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase,MLCK）,MLCK活化后磷酸化MLC,磷酸化的MLC（phosphorylated myosin light chain,p MLC）激活横桥上的ATP酶,进而导致肌丝滑行,引起细胞收缩。参与MLC磷酸化的信号通路主要有Rho/Rho相关激酶通路和Ca2+信号通路等。Rho相关激酶（ROCKs）属于丝氨酸/苏氨酸激酶的AGC家族,是Rho A-GTPase的下游效应器,在调节肌动蛋白细胞骨架动力学和平滑肌收缩性中具有重要的作用。近年来研究发现S100a8对哮喘AHR具有保护作用,但其具体分子机制尚未阐明。S100a8调节AHR的作用是否与其调节气道平滑肌细胞内钙离子浓度和Rho激酶通路有关,目前尚未有文献报道。本文拟通过对AS、EB模型小鼠肺组织进行S100a8蛋白验证,并通过外源性给予S100a8探究其对哮喘模型小鼠AHR的作用及对ASMC内钙离子浓度和Rho激酶表达水平的影响,明确S100a8在哮喘AHR中的具体调节作用和机制。研究目的:通过前期蛋白组学结果及查阅相关文献筛选出AHR相关差异蛋白S100a8蛋白进行验证,并进一步明确S100a8是否通过影响AMSC内Ca2+浓度和Rho激酶表达水平来调节气道平滑肌收缩,进而调节哮喘AHR。研究方法:通过免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）染色对筛选出的差异蛋白S100a8进行蛋白定位,并通过蛋白免疫印迹（western blot,WB）和荧光定量聚合酶链反应（quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,q PCR）技术进行蛋白验证。6-8周龄雌性无特定病原（specific pathogen-free,SPF）级BALB/c小鼠随机分为6组:生理盐水组（NS）、哮喘组（AS组）、AS+2.5μg S100a8组、AS+5μg S100a8组、AS+10μg S100a8组、AS+Terbutaline组。在第0、7、14天,AS、AS+2.5μg S100a8、AS+5μg S100a8组、AS+10μg S100a8组、AS+Terbutaline组使用10μg OVA腹腔致敏;在第21、22、23天,分别使用200μg OVA滴鼻激发,而AS+2.5μg S100a8组、AS+5μg S100a8组、AS+10μg S100a8组、AS+Terbutaline组在滴鼻激发前1小时分别滴鼻2.5μg S100a8、5μg S100a8、10μg S100a8、20μg Terbutaline,AS组激发前给予等量NS滴鼻,NS组给予等量生理盐水腹腔注射和滴鼻,激发后24h进行有创气道反应性检测,观察小鼠气道炎症、粘液分泌和胶原沉积改变,并进一步验证S100a8表达。体外给予S100a8刺激小鼠原代气道平滑肌细胞（ASMC）,观察收缩相关蛋白p MLC/MLC、Rho激酶ROCK1、ROCK2表达水平变化,并使用Fura-2-AM染料进行荧光染色,检测S100a8刺激下ASMC基础Ca2+浓度（F340/380nm）变化。研究结果:S100a8主要以分泌性蛋白形式存在于气道和血管周围。WB和q PCR结果显示,与NS组相比,S100a8在AS小鼠肺组织中的表达增高;与EB组相比,AS组肺组织S100a8表达明显增高。在6.25-50mg/ml MCh激发条件下,AS组小鼠气道反应性较NS组明显增加,而AS+2.5μg S100a8、AS+5μg S100a8、AS+10μg S100a8和AS+Terbutaline组气道反应性较AS组明显降低,AS+5μg S100a8、AS+10μg S100a8和AS+Terbutaline组气道反应性与NS组比较无明显变化;AS+2.5μg S100a8组在12.5mg/ml、25mg/ml MCh激发条件下气道反应性较NS组升高。S100a8可减少肺组织上皮下和血管周围胶原沉积,但气道上皮杯状细胞比例和粘液分泌明显增多。免疫组织化学染色和q PCR结果进一步验证S100a8刺激下小鼠肺组织S100a8表达增加。S100a8显著降低气道平滑肌细胞内基础Ca2+浓度和p MLC/MLC表达水平,但增加Rho激酶通路ROCK1、ROCK2表达水平。研究结论:S100a8可显著缓解OVA诱导的急性过敏性哮喘小鼠模型的气道高反应性,其机制可能与S100a8降低气道平滑肌细胞内Ca2+浓度,减少收缩相关蛋白p MLC/MLC表达及上皮下胶原纤维沉积,抑制气道重塑有关。