微管作为细胞骨架的重要组成部分,参与了细胞形态的建立与维持,细胞运动,胞内物质运输等等重要的细胞生命活动。微管骨架具有极性,并且具有聚合与去聚合的动态性。在微管的正末端,有一系列蛋白调控着微管动态性,这些蛋白被称为微管正端示踪蛋白（Plus-end tracking proteins,+TIPs）。目前已知的微管正端示踪蛋白有22种,这些蛋白大多通过EB （End-binding）家族蛋白而结合到微管正端。尽管这些微管正端示踪蛋白已经被广泛研究,我们对其蛋白网络调控的生化机制及细胞动力学特征却知之甚少。在本论文中,我以EB家族在哺乳动物中最广泛研究的EBl为主角,介绍其C端K220位乙酰化修饰调节与其他微管正端示踪蛋白相互作用,以及持续过乙酰化扰乱其他微管正端示踪蛋白结合到微管正端的故事。我们将利用生物光子学,生物化学与结构生物学等多种手段阐述该乙酰化修饰导致EBl无法结合其他微管正端示踪蛋白的分子机理。同时,我们发现K220乙酰化修饰水平在细胞有丝分裂期明显升高,但是如果人为干扰抑制去乙酰化会激活有丝分裂检验点导致中期延滞。我们的结果提示该乙酰化修饰与有丝分裂期,动点-微管连接的纠错机制相关。在实验过程中,我们发现EBl N端CH结构域上的K66位也存在乙酰化修饰,该乙酰化对动点-微管连接影响不明显,但是调控了纺锤体在细胞中的定位和定向。我们通过研究发现K66位乙酰化可以调控EBl与微管的结合,影响了其定位,进而调控了星体微管的动态性以及纺锤体微管流动速度,最终影响了纺锤体定位及定向。这些结果使我们进一步认识了EBl乙酰化的位点特异性以及动态性乙酰化修饰对细胞有丝分裂进程的影响。由于微管正端在细胞内高度动态而且具有空间差异性,对细胞内不同空间的微管正端精细结构观测成为非常重要的议题。但是由于其结构脆弱不稳定,并且对于甲醛、戊二醛等固定剂敏感,使得电镜在研究微管正端精细结构方面并不具备优势。因此,开发针对微管正端的新型显微观测方法,如光敏定位显微术（PALM）,尤其是活细胞内对微管正末端进行单分子水平的观察就显得很有意义。在本论文中,我们采用近几年新发明的超高分辨率显微学技术,成功突破了200nm的光学分辨率极限,在活细胞中对微管正端示踪蛋白EBl进行了单分子水平的观测,分辨率达到30nm左右。针对EBl分子进行微管正端示踪时的二聚化性质,我们构建了一种可激发型荧光互补系统（Photoactivatable complementary fluorescent system, PACF）,专一性地观测二聚化EBl的分子行为,并且明显降低了背景噪声。利用PACF系统,我们成功地观测到正在迁移的MCF7细胞中存在两种不同类型的EBl微管正末端定位,其分布在迁移前沿和细胞内部具有偏好性,为在单细胞水平研究单分子动态性提供了可行性初探。在我们的实验过程中,还意外地发现在之前的研究中一直被忽视的EBl柔性非保守Linker区对其微管正端定位的重要性,并且引发了我们对于Linker区中阳性氨基酸对其折叠程度影响的研究。我们的研究揭示Linker区的折叠使二聚化EBl的N端的两个球状结构域处于一定的相对位置或角度内,同时具有一定的灵活度,这种特殊的结构特点使得EBl具有独一无二的微管正端示踪特性。综上所述,本论文阐明了蛋白质乙酰化对微管正端示踪核心蛋白EBl与其他+TIPs结合的动态调控规律及结构基础,及在有丝分裂过程中的意义。此外,我们利用超高分辨率显微技术在活细胞中从单分子水平观察了EBl分子的行为,阐述了其在迁移细胞的前沿和胞内区域所具有的两种定位类型,同时揭示了其Linker区域对于微管正端示踪特性的重要作用。这些研究成果有助于进一步认识微管正端动态性及其调控机理。最后,我们在研究过程中构建的可激发型荧光互补系统还为活细胞内单分子水平研究蛋白质-蛋白质相互作用以及监测同源或异源二聚物提供了新型工具,具有良好的应用前景。