目的： 近年来，肝硬化的发病率和病死率逐年升高，已成为继心脑血管和肿瘤之后的又一严重威胁人类生命的重大疾病。在我国病发的肝硬化中，以病毒性肝炎所致的肝硬化最为常见。迄今为止，对于本病的治疗尚无良策，主要是采用对症疗法，疗效不佳。肝脏移植是目前治疗各种终末期肝病的有效方法，但由于供体来源受限，因而限制了临床肝移植研究的进展。近期国内外研究发现，骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)具有多向分化潜能，在一定条件下经体内、体外诱导可定向分化为成骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞、心肌细胞等，有望成为治疗终末期肝病的一种新型种子细胞。但是不同的分化条件(基础培养、细胞密度、机械力、生长因子等)对BM-MSCs分化产生很大影响，BM-MSCs在体外被诱导成肝细胞所需的最佳诱导因子以及其用量还值得进一步的研究。 本实验以此为目的，在体外分离培养BM-MSCs的基础上，采用不同剂量的肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)和成纤维生长因子-2(Fibroblast growth factor-2，FGF-2)分别或联合诱导，观察不同的生长因子及其用量与诱导分化效果的关系，为BM-MSCs临床治疗肝硬化的可行性提供实验依据。 实验方法： 一、BM-MSCs的原代及传代培养选取四周龄、90-100g、雄性、健康的SD大鼠，获取BM-MSCs，在37℃、5％CO2条件下，用含10％胎牛血清的L-DMEM培养液进行贴壁培养，每隔三天换液一次。当细胞铺满全层时，以1:2的比例进行传代培养，三代后获取较为纯化的BM-MSCs。 二、体外定向诱导BM-MSCs向肝细胞样细胞方向分化取第3代的BM-MSCs，分为六组分别诱导。调整细胞浓度至3×105分别接种于放有消毒盖玻片的24孔板内，用含不同生长因子和10％胎牛血清的L-DMEM培养，分组情况如下表： 每隔三天换液一次，定期收集培养液及细胞爬片。 三、鉴定 (一)细胞形态学加入各种诱导成分后，每天用倒置显微镜观察每组并记录细胞形态学的改变。 (二)检测肝细胞特征性标志物1、细胞糖原染色将诱导后12天、24天留取的细胞爬片进行糖原染色。 2、ELISA将诱导后3天、6天、9天、12天、15天、18天、21天、24天留取的细胞上清夜进行ELISA检测细胞AFP的分泌。 3、免疫细胞化学将诱导后12天、24天留取的细胞爬片进行免疫细胞化学检测细胞ALB和CK19的分泌。 实验结果： 1、成功培养出了BM-MSCs，光学显微镜下呈纤维样细胞形态，均一性较高，细胞呈平行排列或漩涡状生长，十天左右可铺满全层。经过3次传代获得较为纯化的BM-MSCs，背景杂细胞明显减少。 2、第一组到第五组经诱导后，形态学有了明显的改变，细胞形态从棱形，多角形，逐渐向纺锤、不规则圆形或多角形增多，10天左右出现卵圆形改变，与肝细胞形态相似。第六组细胞无明显形态学变化。 3、第一组到第五组经诱导后，特别是第一、第二和第四组，行免疫细胞化学检测ALB、CK19以及糖原染色检测糖原分泌12天均有阳性结果，24天阳性率明显增高；ELISA检测AFP，第3天即有分泌，第12天表达最高，以后逐渐减少。第六组无阳性结果。 结论： 1、FGF-2(20ng/ml)、FGF-2(10ng/ml)、HGF(20ng/ml)、HGF(20ng/ml)+FGF-2(10ng/ml)分别能有效地诱导BM-MSCs定向向肝细胞样细胞方向分化。 2、FGF-2(20ng/ml)比HGF(20ng/ml)具有更强的诱导BM-MSCs向肝细胞样细胞分化的能力。 3、FGF-2浓度在10ng/ml以上时，对BM-MSCs向肝细胞样细胞方向分化具有很强的诱导作用，FGF-2浓度在10ng/ml以下时，体外诱导BM-MSCs向肝细胞样细胞方向分化的作用剧减。 4、FGF-2在体外诱导BM-MSCs向肝细胞样细胞方向分化时，对细胞形态学改变影响很大，作用明显强于HGF。