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本论文基于实验室构建的细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救平台（BAC-CHv）,利用无痕缺失技术,对鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）囊膜糖蛋白gI和gE进行单基因缺失株和双基因缺失株构建,获得无外源基因插入的基因缺失重组病毒BAC-CHv-△gI、BAC-CHv-△gE和BAC-CHv-△gI+△gE及其回复株BAC-CHv-△gI Rev、BAC-CHv-△gE Rev和BAC-CHv-△gI+△gE Rev,开展了DPV囊膜糖蛋白gI和gE互作及对DPV组装、释放及细胞间传播的病毒复制过程以及对DPV毒力影响的研究,主要结果如下:1.gI和gE蛋白互作及对DPV组装、释放和细胞间传播功能的影响本论文首先确定DPV gI和gE蛋白发生相互作用,形成gI/gE复合物,同时发现gI蛋白影响gE蛋白分子大小。病毒生长曲线试验确定gI/gE复合物促进病毒在细胞内形成完整病毒粒子、促进完整病毒粒子释放到细胞上清;确定单独表达gI或gE蛋白抑制病毒在细胞内形成完整病毒粒子、抑制完整病毒粒子释放到上清。透射电镜试验进一步确定gI/gE复合物通过参与病毒二次囊膜包被过程完成病毒组装,继而促进病毒在细胞内形成完整病毒粒子;单独表达gI或gE蛋白抑制病毒二次囊膜包被过程影响病毒组装,继而抑制病毒在细胞内形成完整病毒粒子。透射电镜试验确定gI/gE复合物促进完整病毒粒子释放,单独表达gI或gE蛋白促进未包被核衣壳释放抑制完整病毒粒子释放。病毒噬斑试验确定gI/gE复合物促进DPV在细胞间传播,但单独表达gI或gE蛋白抑制DPV在细胞间传播。2.gI蛋白对DPV在细胞间传播及二次囊膜包被的作用2.1 CHv-△gI缺失重组病毒感染鸭胚成纤维细胞后gE蛋白定位和表达情况分析本论文构建了一株无EGFP绿色荧光蛋白和gI蛋白表达的CHv-△gI缺失重组病毒。利用间接免疫荧光试验确定DPV gI蛋白可协助gE蛋白由内质网定位在高尔基体。利用Western blot试验、间接免疫荧光试验和糖链酶切试验确定在DPV gI蛋白表达的情况下gE蛋白分子量增大是由于其协助gE蛋白定位在高尔基体并在高尔基体发生O-糖基化修饰导致。2.2影响gE蛋白高尔基体定位的gI蛋白的关键氨基酸结构域的筛选高尔基体作为病毒在细胞间传播过程和病毒二次囊膜包被过程发生的关键位点,缺失gI蛋白后gE蛋白无法在高尔基体定位是导致其不能独立参与病毒在细胞间传播过程和病毒二次囊膜包被过程的原因。在gI蛋白第1-82、1-106、1-158、1-279、1-302和1-317位氨基酸处,构建了包含gI蛋白胞外域N端、胞外域C端、跨膜区和胞内域的截段真核表达质粒,利用间接免疫荧光试验确定gI蛋白胞外域N端1-158位氨基酸将gE蛋白滞留在内质网,gI蛋白胞外域C端1-279位氨基酸协助gE蛋白定位在高尔基体。构建缺失编码gI蛋白159-371和280-371位氨基酸的缺失重组病毒BAC-CHv-△gI（159-371）和BAC-CHv-△gI（280-371）,利用间接免疫荧光试验进一步确定gI蛋白胞外域N端将gE蛋白滞留在内质网,gI蛋白胞外域C端协助gE蛋白定位在高尔基体。2.3确定gI蛋白促进gE蛋白由内质网释放并定位至高尔基体的原因根据内质网蛋白质量控制系统释放正确折叠和组装的蛋白质至高尔基体、滞留错误折叠和组装蛋白至内质网这一特性,利用免疫共沉淀试验确定gI蛋白1-158位氨基酸和1-279位氨基酸均可与gE蛋白发生相互作用形成复合物。gI蛋白1-158位氨基酸与gE蛋白形成的复合物在内质网中被识别为错误折叠蛋白复合物并被滞留在内质网无法定位在高尔基,gI蛋白1-279位氨基酸与gE蛋白形成的复合物在内质网中被识别为正确折叠蛋白复合物被内质网释放并定位在高尔基体。即只有gI蛋白和gE蛋白形成可被内质网蛋白质量控制系统识别的正确折叠复合物后,才可由内质网释放并定位在高尔基体。3.gI蛋白对DPV毒力的影响将103、104、105和106TCID50的gI基因缺失重组病毒（CHv-△gI株）和DPV强毒50代细胞传代毒（CHv-50株）感染10只28日龄鸭,比较两个毒株感染鸭后临床症状、病理变化、各器官病毒载量等方面的差异。结果表明,（1）与CHv-50亲本株相比,各感染剂量CHv-△gI缺失重组病毒感染后不引起鸭体温升高、不引起鸭死亡、不引起明显的鸭组织器官临床病理变化,而CHv-50亲本株感染后,鸭体温升高至43℃以上,且感染后鸭发生死亡,并在胸腺、肝脏等器官中发现出血、肿大现象。表明gI基因缺失后DPV的毒力降低,对鸭无显著致病性,gI基因为DPV毒力基因之一。（2）QPCR检测CHv-50亲本株、CHv-ΔgI缺失重组病毒感染鸭后不同组织器官基因组拷贝数,结果显示与CHv-50亲本株相比,CHv-△gI缺失重组病毒感染后第1-9天,鸭免疫器官和实质器官平均基因组拷贝数维持在104 copies/g左右,而CHv-50亲本株感染后,鸭免疫器官平均基因组拷贝数、实质器官平均基因组拷贝数均增加至105-109copies/g以上。表明CHv-△gI缺失株在鸭免疫器官和实质器官复制能力被抑制是病毒毒力减弱无法引起鸭死亡的主要原因之一。综上可知,DPV gI和gE蛋白在DPV形成过程中发生相互作用,形成的gI/gE复合物能够促进病毒在细胞间传播、通过参与病毒二次囊膜包被过程完成病毒组装促进病毒在细胞内形成完整病毒粒子、促进完整病毒粒子释放到细胞上清;gI和gE蛋白无法独立完成上述过程,当单独表达gI或gE蛋白时抑制病毒在细胞间传播、通过降低病毒二次囊膜包被效率影响病毒组装从而抑制病毒在细胞内形成完整病毒粒子、促进未包被核衣壳释放而抑制完整病毒粒子释放到上清。同时发现,DPV gI蛋白与gE蛋白形成可被内质网蛋白质量控制系统识别的正确折叠复合物后促进gE蛋白定位在高尔基体并促进其在高尔基体完成O-糖基化修饰、病毒二次囊膜包被过程和病毒细胞间传播过程。DPV gI蛋白为DPV的毒力基因之一,CHv-△gI缺失重组病毒在鸭免疫器官和实质器官复制能力被抑制是病毒毒力减弱无法引起鸭死亡的主要原因。