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成骨肉瘤(osteosarcoma)是骨的原发性恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的0.2％，每年每百万人口将有2—3例的成骨肉瘤患者发病。大多数患者的发病年龄为10—20岁。传统的治疗方法预后差，5年生存率不足20％。近年来随着新的化疗、热疗及免疫治疗的兴起，使成骨肉瘤的5年以上生存率大为提高。 随着高温治疗恶性肿瘤的应用愈加广泛，对成骨肉瘤的体内外热疗也做了大量的研究，但由于组织块的热疗条件难以准确控制，在加热方法的可靠性以及瘤细胞的灭活效果、机理和预后等问题还存在着一定的疑问，为此我们采取肿瘤细胞体外加温加热的方法进一步探讨热疗对恶性骨肿瘤细胞的灭活作用及其部分机理。 目的 1．探讨两株不同转移活性的成骨肉瘤细胞的体外灭活最佳温度及时间。 2．探讨热疗诱导成骨肉瘤细胞凋亡，为中低温度热疗治疗成骨肉瘤提供 第四军区大学硕士学位论文一 理论依据。 方法 1．不同温度不同时间对 OS－990和 SOSPM3成骨肉瘤细胞系加热作用 后，用 MTT法测定琉琅酸脱氢酶八nununohistochemistry，SDH）活性以 及用肿瘤干细胞集落形成法测定集落形成能力。 2．用透视电镜观察 43．5 aC比热疗后不同时间组 OS－990成骨肉瘤细胞 系的形态，了解热疗对凋亡中的细胞超微结构的影响。 3．应用 DNA凝胶电泳了解 43．SC lh热疗对 OS－9901成骨肉瘤细胞系的 生化影响。 4．通过免疫组织化学染色，观察43．5 oC lh热疗对OS－9901成骨肉瘤细 胞系的p53、bC12蛋白表达的影响。 结果 1．两株不同转移性的成骨肉瘤细胞系对热的敏感性是一致的。 2．成骨肉瘤细胞的SDH活性随着温度升高和时间延长而降低。 3．随着加热温度的升高及加热时间延长肿瘤干细胞的集落形成能力不 断下降，45OC 60min或46C 30min以上时成骨肉瘤细胞基本无集落 形成能力。 4．电镜下43．SC lh作用的成骨肉瘤细胞继续培养12h后出现大量异常 细胞，可见典型凋亡特征性形态改变：包膜出芽，芽内可见核物质。 包核固缩，染色质边集，核膜破裂崩解，内质网肿胀、崩溃、自溶， 可见凋亡小体。 5．电泳可见 43．5 CIh作用的成骨肉瘤细胞继续培养 12h后细胞 DNA －5－ 第回军巴大学刁士学位论文一 形成了梯形电泳模式，这是发生凋亡的标志。空白对照组未见明显的 凋亡降解片段。 6．免疫组织化学显示，43．5 oCIh作用的成骨肉瘤细胞 Bcl－二的表达在 12小时较对照组无明显减少。P53的的表达在12小时较对照组明显 增加。 结论 1．50C 30min可以作为成骨肉瘤热疗的温度时间。 2．43．5℃lh作用可以诱导OS－9901成骨肉瘤细胞凋亡。此结果为电镜 及DNA电泳结果所证实。 3．热疗后骨肉瘤细胞p53表达增加，从而进一步诱导发生细胞凋亡，为 热疗诱导肿瘤细胞凋亡的机理提供了部分理论依据。