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甘草次酸是五环三萜化合物的一种,由于其广谱的药物活性和特殊的中间体结构被广泛地应用于医药、化妆品和食品等领域,具有抗炎、抗病毒、降血脂、防治肿瘤和抗艾滋病等多种作用,也是一种极其重要的解毒剂。甘草次酸目前主要由甘草酸水解产生,生产工艺复杂、周期长、耗能高、污染环境、成本高、产品收率低,不符合绿色发展理念。随着代谢工程与合成生物学的不断发展,人工构建微生物在合成天然产物方面显示出了独特的优势,已成为国际工业生物技术研究的焦点。本研究利用分子生物学技术和代谢工程手段,在酿酒酵母中引入异源甘草次酸合成途径,并对甘草次酸合成途径进行优化,结合优化发酵方式和改变碳源的来源,提高酿酒酵母工程菌中甘草次酸的产量。研究结果如下:通过文献检索和酿酒酵母全基因组序列分析,确定并克隆了用于控制功能基因表达的启动子和终止子;依据酿酒酵母密码子的偏好性,密码子优化后化学合成了来源于光果甘草中的β-香树脂醇合酶b AS、P450单加氧酶CYP88D6和CYP72A154;克隆获得了来源于拟南芥的P450还原酶At CPR1和At CPR2。按照启动子—功能基因—终止子模式通过重叠延伸PCR构建了β-香树脂醇合酶、P450单加氧酶和P450还原酶的基因表达盒,并通过同源重组方式将基因表达盒整合到单倍体酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组上,在酵母中实现了甘草次酸人工合成途径的构建,液相色谱质谱证明在工程菌中成功合成目标产物甘草次酸,产量达到25.5μg/L。分别以单倍体酿酒酵母CEN.PK2-1C、CEN.PK2-1D和二倍体酿酒酵母INVSc1为底盘宿主,研究了甘草次酸合成途径与底盘宿主的适配性关系,发现以单倍体酿酒酵母为底盘宿主更有利于甘草次酸的合成,比以二倍体酿酒酵母INVSc1为底盘宿主时甘草次酸产量提高了100%。以三萜合成途径中的直接前体物2,3-氧化鲨烯为代谢调控节点,过表达酿酒酵母内源基因鲨烯单加氧酶(ERG1)促进鲨烯转化为2,3-氧化鲨稀,过表达鲨烯合酶(ERG9)以提高鲨烯供应,使甘草次酸的产量提高到36.1μg/L。从发酵工程角度考虑,以补料批式发酵方式培养工程酿酒酵母,发酵结果表明,以葡萄糖为碳源补料批式发酵时,甘草次酸产量提高了71.8%,当以乙醇补料批式发酵时,甘草次酸产量达到48.6μg/L,比葡萄糖为碳源补料批式发酵提高了73%,说明乙醇作为碳源更有利于甘草次酸的合成。