心肌梗死（myocardial infarction,MI）是冠状动脉内不稳定的粥样斑块破溃、血栓形成进而造成冠状动脉完全闭塞引发的一系列的病理生理改变,作为冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease,CHD）的基本类型之一,MI的发病率、致死率呈逐渐上升趋势,给全球的公共卫生事业发展带来了极大的经济负担。现代研究表明,威胁MI后患者生存与预后的重要因素为心律失常、心力衰竭（heart failure,HF）等并发症,其中约50%的患者死于心肌梗死后的致命性室性心律失常（ventricular arrhythmias,VAs）。MI后室性心律失常的发生是神经重构、电重构、心肌重构、各种细胞因子表达等多种病理生理因素共同参与的结果,随着研究的不断深入MI后交感神经重构同室性心律失常的关系日益引起广大学者的重视,MI发生后,早期梗死中央区域出现神经坏死,表现为交感神经去支配现象,而后期梗死灶周区域出现交感神经再生及过度再生,表现为交感神经高支配现象,进而在梗死的区域存在着交感神经分布与功能的显著性差异及离散,这种不均一改变即构成了室性心律失常发生的神经基质,导致MI后室性心律失常的易感性明显升高。此外,交感神经过度激活,儿茶酚胺类活性物质分泌增多,细胞毒性增加,心肌细胞凋亡、坏死,对心功能也造成了一定的影响。因此,MI后交感神经重构在室性心律失常发生、心功能改变的过程中发挥着至关重要的作用,其机制研究具有重要的临床意义。目前,越来越多的证据表明炎症和相关的细胞因子在刺激神经轴突生长和再生的过程中起关键作用,参与并影响着MI后交感神经重构的过程。嘌呤能离子通道型受体 7（purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor,P2X₇R）在体内众多器官、组织及细胞中普遍分布,在多种炎性病理状态下表达上调,参与调节炎性因子的表达与释放,已陆续证实P2X₇R与多种炎症性疾病有着密切的关系,拮抗P2X₇R的表达对炎症性疾病的具有一定的治疗作用,除此之外,大量研究表明P2X₇R参与调控大脑皮层神经元损伤过程,抑制其表达能够改善炎症反应加剧的神经退行性变,因此,在中枢神经系统疾病调节中发挥着重要病理生理学功能,然而,P2X₇R是否参与MI后的交感神经重构的过程尚未有相关研究。现已证实P2X₇R的激活刺激细胞信号分子发生磷酸化,包括细胞外信号调节激酶（ERK1/2）和p38促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化,从而触发活性氧产生、核因子kappaB（NF-κB）活化。NF-κB是多种免疫应答的中枢调节剂,是一种广泛存在的转录因子,在正常条件下,NF-κB与细胞质中NF-κB的抑制剂（IκB）结合,激活后,IκB蛋白被降解,游离的NF-κB转移到细胞核,诱导肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）等促炎细胞因子的表达,一些学者已经在MI后心脏组织中检测到活化的NF-κB,我们团队以往的工作证明MI发生后激活NF-κB,PDTC抑制NF-κB活化后通过下调NGF（nerve growth factor,NGF）表达来改善交感神经重构,另有学者通过观察NF-κBp65的表达变化发现嘌呤能信号可以通过P2X₇R来激活NF-κB。这意味着P2X₇R或许参与心肌缺血坏死后的炎症过程,以及潜在地参与NF-κB变化调节,但是P2X₇R是否直接参与MI后的交感神经重构仍然是未知的。在本项研究中,我们假设MI后P2X₇R激活通过参与炎症反应的调节进而参与神经重构的过程,首先检测了大鼠MI后梗死灶周组织P2X₇R的动态表达,其次,我们利用基因干扰技术沉默P2X₇R表达进一步观察了其在大鼠MI后交感神经重构中的作用及相关机制,同时,我们观察了 P2X₇R对大鼠MI后心功能及室性心律失常易感性的影响,该研究或许将为抑制MI后心脏交感神经重构、减少MI后恶性室性心律失常的发生、改善心功能提供新的理论依据及治疗靶点,为了系统阐述以上问题,本研究将分为以下两部分展开实验并探讨:第一部分大鼠心肌梗死后P2X₇受体的表达研究目的:建立大鼠心肌梗死模型,明确心肌梗死灶周组织P2X₇R的动态表达过程,进而为明确P2X₇R是否参与MI后交感神经重构的研究打下基础,为梗死后室性心律失常、心力衰竭的防治提供新的治疗靶点。研究方法:将27只SD大鼠通过开胸永久性结扎左冠状动脉前降支的方法制作心肌梗死的模型,空白对照组（sham组）只开胸前降支穿线不结扎,将存活大鼠按照取材时间随机分为以下6组:0-MI组,0.5-MI组,1-MI组,3-MI组,5-MI组和7-MI组及各组的空白对照组:即在MI后即刻、0.5天、1天、3天、5天、7天后进行处死,选取大鼠心肌梗死灶周组织通过Western blot、实时定量RT-PCR检测P2X₇R蛋白及mRNA表达。研究结果:造模过程中大鼠心电监测示ST段抬高,提示心肌梗死造模成功,Western blot、实时定量RT-PCR检测提示大鼠在心肌梗死后0.5天P2X₇R表达轻微上调,在1天时表达明显上调,直至第7天一直保持在高水平。研究结论:大鼠MI后梗死灶周组织存在P2X₇R动态表达,在梗死后0.5天表达轻度上调,在第1至第7天表达仍保持在较高水平,这提示P2X₇R有可能通过调节心肌梗死后炎症因子的表达参与梗死后交感神经重构的调节。第二部分P2X₇受体对大鼠心肌梗死后交感神经重构及心功能的影响及机制研究目的:通过向MI大鼠梗死灶周组织注射Ad-P2X₇R-shRNA干预P2X₇R表达,明确P2X₇R是否参与梗死后炎性因子表达、交感神经重构的过程,以及明确这一过程是否通过NF-κB途径介导;阐明P2X₇R参与MI后交感神经重构的部分机制;进一步探索干扰P2X₇R表达对降低MI后室性心律失常易感性、改善心功能的治疗意义。研究方法:将75只SD大鼠随机分为假手术组（sham组）（n = 15）,MI-vehicle组（MI+0.9%NS 组）,MI-GFP 组（MI+Ad-GFP 组）和 MI-shRNA 组（MI+Ad-P2X₇R-shRNA组）（n = 20/组）。成功构建MI模型后,各组在左心室的梗死灶周心肌注射等量溶液（80μl;2.5×1011vg/ml）。其中,sham组未做处理,MI-vehicle组接受生理盐水注射,MI-GFP组接受Ad-GFP-shRNA注射,MI-shRNA组接受Ad-P2X₇R-shRNA注射,在MI后第7天请超声心动图专家进行血液动力学测量并采用程序性电刺激诱发心律失常进行电生理测试,然后处死大鼠,收集心肌组织样品用于以下检测。1.实时定量RT-PCR检测心肌中P2X₇R mRNA表达;2.Western blot 检测心肌组织中P2X₇R、Akt、Ser 473、ERK1/2、NF-κBp65、NF-IkBα、NGF、TH、GAP43 蛋白表达;3.采用免疫组织化学方法观察CD68、IL-1β表达,了解炎性细胞浸润及炎症因子表达情况;4.通过Masson染色,在心脏组织切片上评估梗死面积;5.免疫荧光检测Ad-P2X₇R-shRNA心肌细胞转染效果、观察TH、GAP43阳性神经纤维的形态及分布了解交感神经再生情况;6.酶联免疫吸附试验检测心肌中NE的浓度,了解梗死灶周交感神经活性。研究结果:1.心脏血液动力学参数:同sham组相比,MI-vehicle组和MI-GFP组大鼠LVEDP显著升高,EF值显著降低,MI 各组（MI-vehicle 组、MI-GFP 组、MI-shRA 组）dP/dt max 和dP/dt min的显著降低;同MI-vehicle组相比,MI-shRNA组LVEDP显著降低,EF 值、dP/dt max 和 dP/dt min 显著升高。2.心脏电生理参数:Sham组、MI-vehicle组、MI-GFP组、MI-shRNA组室性心律失常的诱发率分别为 20%、62.5%、66.7%、29.4%,同 Sham 组相比,MI-vehicle 组、MI-GFP组大鼠心律失常易感性均明显升高,且两组间无统计学差异;同MI-vehicle组相比,MI-shRNA组大鼠心律失常易感性明显降低。3.P2X₇R mRNA及蛋白表达及基因沉默效果:GFP荧光成像发现,MI-GFP组、MI-shRNA组的腺病毒载体可成功转染大鼠梗死灶周心肌细胞;进行RT-PCR和Western blot检验进一步发现,同Sham组相比,MI-vehicle组、MI-GFP组P2X₇R的mRNA和蛋白表达水平均明显上调,且两组间无统计学差异,同MI-vehicle组相比,MI-shRNA组中P2X₇R表达明显减少,说明以重组腺病毒为载体的P2X₇R-shRNA可有效抑制P2X₇R的表达。4.NF-κB信号通路的激活:同sham组相比,MI各组NF-κB p65核蛋白表达上调,IκBα胞质蛋白中表达降低,NF-κB发生核易位,提示MI后NF-κB信号通路显著激活;同MI-vehicle组相比,MI-shRNA组中核蛋白NF-κB p65表达减少,胞质蛋白中IκBα含量表达增加,NF-κB核易位减弱,提示MI后P2X₇R RNAi可抑制NF-κB信号通路激活。同时NF-κB的上游激活分子磷酸Akt（Ser 473）和磷酸Erk1/2水平变化同上述NF-κB核易位变化趋势相一致,说明MI后P2X₇R通过Akt和Erk1/2信号途径调节NF-κB的激活表达。5.梗死灶周炎性细胞浸润及炎症因子IL-1β的表达:同sham组相比,MI各组CD68阳性巨噬细胞和IL-1β的表达显著增加,提示梗死灶周炎性浸润明显;同MI-vehicle组相比,MI-shRNA组CD68阳性巨噬细胞和IL-1β表达显著减少,提示MI后沉默P2X₇R表达可使炎性浸润程度明显减弱,炎症因子表达减少。6.NGF蛋白表达:同sham组相比,MI各组NGF蛋白表达明显升高;同MI-vehicle组相比,MI-shRNA组NGF蛋白表达明显减弱。7.神经纤维分布及蛋白表达:（1）GAP43阳性神经纤维:Sham组GAP43阳性神经纤维少见甚至是缺如;同Sham组相比较,MI各组GAP43阳性神经纤维的密度显著增加;同MI-GFP组相比,MI-shRNA组神经纤维的密度明显降低。（2）TH阳性神经纤维:Sham组TH阳性神经纤维均匀的分布于心肌纤维间,并且同心肌纤维保持走形一致;同Sham组相比较MI各组TH阳性神经纤维的密度明显增加,形态粗大,而且在空间分布上表现混乱,两组之间表现无统计学差异;同MI-vehicle组相比,MI-shRNA组TH阳性神经纤维密度明显降低,形态及分布更趋于正常。8.心肌组织中NE浓度同sham组相比,MI-vehicle组及MI-GFP组的梗死灶周的心肌NE水平明显升高,在P2X₇R沉默后,梗死灶周NE水平显着低于MI-vehicle组,即MI-vehicle组和MI-GFP组交感神经活性明显升高,沉默P2X₇R表达后交感神经活性降低趋于正常。研究结论:1..P2X₇R在MI后表达上调,促进Akt（Ser 473）和Erk1/2磷酸化,激活NF-κB信号通路,增加IL-1β表达,上调NGF表达,参与交感神经重构;增加MI后室性心律失常易感性、心功能恶化。2.运用Ad-P2X₇R-shRNA在梗死灶周局部注射可成功沉默P2X₇R基因转录表达。3.MI发生后采用短发卡RNA技术沉默P2X₇R表达,可抑制Akt（Ser 473）和Erk1/2磷酸化及下游NF-κκB信号通路激活,下调IL-1β表达,使NGF表达减少,交感神经过度再生减弱。4.P2X-7R基因沉默可抑制MI后交感神经重构起到抗心律失常、改善心功能的作用,为临床防治MI后室性心律失常、改善心功能提供新的治疗靶点。