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谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporters,VGLUTs)存在于囊泡膜上,能够将神经递质转运至突触囊泡内,并由此将神经递质谷氨酸释放到突触间隙而产生突触后效应。VGLUTs通过依赖氢离子浓度梯度来进行神经递质的摄取与释放。到目前为止,共有VGLUT1-3三种主要类型的转运体被发现,而第三种转运体VGLUT3分布相对局限,而且对其功能知之甚少。表达于神经元的VGLUT3经典的转运机制是与其他神经递质,如5-轻色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)一同进行协同转运,而VGLUT3在5-羟色胺能神经元所促成的谷氨酸信号可促进5-HT的信息传递。单胺神经递质5-HT向突触囊泡内的转运和由突触前膜的释放,有赖于囊泡单胺能转运体2(vesicular monoamine transporter 2,VMAT2)的正常表达和运转。VGLUT3和VMAT2在同一个神经元内的共存现象进一步揭示了不同神经递质协同转运的机制。作为将周围的躯体感觉和内脏感觉信息向中枢神经系统(central nervous system,CNS)传递的背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)初级传入神经元和将听觉信息向CNS传递的螺旋神经节神经元(spiral ganglion neuron,SGN),在处理不同的信息传递过程中均有赖于神经递质的转运、储存和释放,而这一系列的过程又有赖于转运体的正常表达和运转,而VGLUT3和VMAT2在DRG和SGN初级传入神经元的表达以及调节机制仍不完全明确。作为神经营养素(neurotrophin,NT)家族的重要成员之一,脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在周围神经系统(peripheral nervous system,PNS)发育过程中发挥重要的作用。BDNF发挥生物学作用的过程是通过与其特异的高亲和力酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)结合,进而激活其下游的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷脂酿肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)和磷脂酶 Cγ(phospholipase C gamma,PLCy)细胞信号转导通路。但是,BDNF是否对DRG和SGN初级传入神经元VGLUT3和VMAT2的表达具有影响作用,目前尚不明确,BDNF对于神经元的突起生长与转运体表达调控之间的关系尚需要进一步研究。基于以上研究背景,本课题分别应用原代培养DRG和SGN神经元,研究外源性BDNF对转运体VGLUT3和VMAT2的表达调控作用及其机制,探讨BDNF对VGLUT3和VMAT2的表达调控中细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase 1/2,ERK1/2)、PI3K/Akt 和 PLCγ 三种信号通路所参与的作用,并进一步用用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)进行VGLUT3和VMAT2的干扰实验来探究VGLUT3和VMAT2在BDNF引起的神经突起生长过程中的作用机制;为进一步确定转录因子Etv4和Etv5在促进神经元生长中的确切机制,本课题通过siRNA干扰实验干扰Etv4和Etv5的表达或构建Etv4和Etv5过表达载体并转染DRG神经元使Etv4和Etv5过表达,来明确其在BDNF信号调节DRG神经元突起的生长过程中所发挥的作用。第一部分BDNF对DRG神经元VGLUT3和VMAT2表达的调控作用本课题利用原代培养的DRG初级传入神经元,研究了 BDNF及其相应的细胞信号传导通路参与VGLUT3和VMAT2表达的调控作用,以及这种调控机制与神经元的突起生长之间的关系。结果显示,BDNF促进DRG神经元的突起生长和生长相关蛋白43(growth-associated protein 43,GAP-43)的表达呈剂量依赖效应。而且,BDNF能够上调转运体VGLUT3的表达,很可能是通过激活下游PLCγ信号通路起作用的。虽然BDNF没有能够上调VMAT2的表达,但是在DRG神经元中,在外源性BDNF作用下通过抑制PI3K或PLCγ信号通路可以抑制VMAT2的表达,这一结果显示,BDNF对VMAT2表达的调控作用不如对VGLUT3表达的调控作用明显,但BDNF下游的相关细胞信号通路也可能介导了 VMAT2的表达。通过siRNA干扰VGLUT3和VMAT2的表达后,BDNF对突起生长的促进作用和GAP-43的表达上调并没有受到显著影响,BDNF对VGLUT3表达的独特作用阐释了在DRG初级传入神经元中外源性BDNF对谷氨酸信号传入的调控可能存在不同的机制。BDNF引起的VGLUT3表达上调可能是BDNF调节神经病理性疼痛的一个重要机制。BDNF信号在初级传入神经元中通过调节转运体所介导的生物学效应,对于解释BDNF介导神经病理性疼痛的作用机制增添了新的研究内容。第二部分BDNF通过激活转录因子Etv4和Etv5促进转运体VGLUT3的表达和DRG神经元的生长本课题设计了以检测和影响转录因子Etv4和Etv5表达为主线的实验,探讨了 BDNF及其相关的细胞信号转导通路对Etv4和Etv5表达的影响作用,通过特异性的siRNA干扰Etv4和Etv5的表达、通过转染Etv4和Etv5过表达载体使Etv4和Etv5的表达水平上调的实验条件下,BDNF及其相关的细胞信号转导通路对生长相关蛋白GAP-43以及神经元结构蛋白中分子量神经丝蛋白(medium neurofilament,NF-M)和轻分子量神经丝蛋白(light neurofilament,NF-L)表达变化的影响,进而分析在这种特有的实验条件下DRG神经元突起生长或再生的机制,并在siRNA干扰Etv4和Etv5表达的条件下,在BDNF存在时VGLUT3和VMAT2的表达变化,试图阐明转录因子Etv4和Etv5所介导的、在BDNF存在时,DRG神经元突起生长或再生的机制及其与VGLUT3和VMAT2表达之间的关系。结果显示,外源性BDNF孵育可显著上调Etv4和Etv5及其mRNA的表达水平,BDNF上调Etv4和Etv5表达的效应可能是通过激活其下游的ERK1/2信号通路而实现的;Etv4siRNA或Etv5 siRNA可使BDNF孵育状态下,生长相关蛋白GAP-43以及神经元结构蛋白NF-M、NF-L的表达水平下调,这与在同样实验条件下DRG神经元突起的缩短是一致的;过表达Etv4或Etv5可使BDNF孵育状态下,生长相关蛋白GAP-43以及神经元结构蛋白NF-M、NF-L的表达水平上调,这与在同样实验条件下DRG神经元突起的延长是一致的;Etv4 siRNA或Etv5 siRNA可阻止BDNF孵育状态下VGLUT3表达上调的趋势,而对VMAT2表达的影响作用不明显。以上结果表明,BDNF可通过上调转录因子Etv4和Etv5的表达而诱发生长相关蛋白GAP-43的表达,并启动神经元结构蛋白NF-M、NF-L的表达,在DRG神经元突起生长或再生过程中发挥重要的作用,这可能是DRG神经元突起生长并发育成熟的重要机制;BDNF还可通过上调转录因子Etv4和Etv5的表达而使VGLUT3表达上调,这可能是BDNF上调VGLUT3表达而增强兴奋性氨基酸谷氨酸信息传递效能的重要机制之一,这与BDNF所介导的机械性痛觉信息传递或机械性痛觉过敏的作用是一致的。Etv4和Etv5作为初级传入神经元BDNF及其受体信号系统调控神经元突起生长以及上调转运体VGLUT3表达的关键转录因子,在神经元突起生长或再生中所发挥的关键作用以及对转运体VGLUT3表达的调控所产生的重要作用,不仅对于揭示以BDNF及其受体信号系统为主导的促神经元突起生长的机制增添了新的实验依据,而且对于其在以调控转运体VGLUT3表达为关键步骤的增强谷氨酸信号传递的机制方面提供了新的理论基础。第三部分BDNF对螺旋神经节神经元VGLUT3和VMAT2的调控作用本课题应用原代培养的螺旋神经节神经元(spiral ganglion neuron,SGN),研究外源性BDNF对于初级传入SGN转运体VGLUT3和VMAT2表达的可能调控作用及其可能的机制,并探究这种调控机制与SGN存活和突起生长的关系。结果显示,外源性BDNF不仅可以通过激活其下游的PI3K/Akt信号通路发挥对SGN中VGLUT3表达上调的作用,而且对SGN神经元突起的生长和SGN神经元存活具有促进作用;在本实验的特定条件下,外源性BDNF尚不能调控SGN中的单胺类转运体VMAT2的表达;BDNF促进SGN突起生长和增加神经元存活率与转运体VGLUT3和VMAT2表达模式之间的关系并不明显,说明BDNF对SGN的神经生长和存活的调控存在多种机制。外源性BDNF对SGN中VGLUT3表达的调控模式可能是SGN内BDNF调控谷氨酸能信号传递的机制之一,而且BDNF对SGN神经元突起的生长和SGN神经元存活的促进作用对于耳蜗正常功能的维持具有重要的意义。