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目的:随着我国工化、城镇化进程的加快,环境问题也越来越多的受到人们的关注。空气污染影响着人类健康,空气中的细颗粒物PM2.5具有直径小,表面积大,含有有机化合物以、重金属及致病菌的特点,是空气污染引发机体疾病的重要因素。在临床工作中,空气污染严重的季节往往是慢性阻塞性肺疾病急性加重以及肺部感染性疾病的高发的季节,因此探索有效的方法应对空气污染对呼吸系统健康的不利影响十分重要。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是抗氧化反应的主要调节器,它的许多下游靶基因参与纠正细胞内氧化还原失衡。由于呼吸系统持续暴露于存在各种污染物及氧化剂的外部环境,Nrf2维持的氧化还原平衡对维持气道健康十分关键。迄今为止,研究人员发现Nrf2缺失会导致多种呼吸系统疾病,包括呼吸道感染、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、哮喘、肺纤维化(IPF)等,而激活Nrf2对这些肺部疾病具有保护作用。铁死亡(ferroptosis)是近年来发现的一种新的程序性细胞死亡方式,其主要特征是脂质活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)以铁依赖的方式过量积累。铁死亡参与许多肺部疾病的发生、发展,其在慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、肺部感染、哮喘以及急性肺损伤的发病过程起关键作用。有报道称PM2.5可引发上皮细胞、小鼠肺组织及人支气管上皮细胞铁死亡,然而其确切机制以及Nrf2在这一过程中发挥的作用并不清楚。本研究旨在探究Nrf2信号通路在PM2.5诱导的肺损伤及铁死亡的作用机制,为缓解空气污染引发呼吸系统疾病探索新的靶点。方法:本实验拟通过PM2.5诱导的C57BL/6小鼠模型和人支气管上皮细胞(BEAS-2B)模型来深入研究Nrf2信号通路通过调控铁死亡缓解PM2.5诱导的肺损伤的机制。1.动物实验:将C57BL/6野生型(Wild-type,WT)小鼠和Nrf2敲除型(Nrf2knockout,Nrf2-/-)小鼠都随机分成空白组和PM2.5暴露组(共4组每组8只小鼠)。操作方法:在SPF条件下饲养3天。室温下用无菌生理盐水将PM2.5稀释至终浓度220μg/50μl。对于PM2.5暴露组,每天经鼻滴入PM2.5生理盐水溶液50ul,非暴露组每天经鼻滴入生理盐水50ul,PM2.5刺激7天。最后一次刺激后24 h处死小鼠,分别收集支气管灌洗液(BALF),血液以及肺组织。Nrf2-/-小鼠和WT小鼠分别购自杰克逊实验室以及北京(证书SYXK(吉)2019-0012)。(1)应用酶联免疫吸附实验(ELISA)分别检测小鼠支气管灌洗液中炎性因子TNFα和IL-6。(2)取小鼠肺组织分别进行HE、PAS和DAB染色。(3)应用相应试剂盒检测小鼠肺组织中铁离子、MDA和GSH含量。(4)应用免疫印迹法(Western Blot)检测小鼠肺组织中Nrf2、HO-1、NQO1、x CT、GPX4、TFR、FTH1、FTL的蛋白表达情况。2.细胞实验:用Nrf2 si RNA转染BEAS-2B细胞72小时,然后用抗Nrf2抗体(1:1000)进行Western blotting,以评估其转染效率,选择转染效率最高的si RNA组进行后续的细胞实验。用铁死亡抑制剂Fer-1预处理正常的BEAS-2B细胞以及Nrf2敲低的BEAS-2B细胞1小时,然后用PM2.5分别诱导两组细胞18 h,收集细胞。用Nrf2激活剂萝卜硫素(SFN)预处理BEAS-2B细胞1小时,然后用PM2.5诱导18小时,收集细胞。(1)采用CCK-8法检测PM2.5诱导的正常BEAS-2B细胞和Nrf2敲低BEAS-2B细胞的毒性作用。(2)共聚焦铁橙染色检测PM2.5诱导的正常BEAS-2B细胞和Nrf2敲低的BEAS-2B细胞中铁离子水平。(3)检测PM2.5诱导的正常BEAS-2B细胞、Nrf2敲低的BEAS-2B细胞以及Nrf2激活的BEAS-2B细胞中ROS产生情况。(4)应用相应试剂盒检测PM2.5诱导的正常BEAS-2B细胞、Nrf2敲低的BEAS-2B细胞以及Nrf2激活的BEAS-2B细胞中铁离子、MDA和GSH的含量。(5)应用免疫印迹法(Western Blot)检测PM2.5诱导的HBEC细胞、Nrf2敲低的BEAS-2B细胞以及Nrf2激活的BEAS-2B细胞中Nrf2、HO-1、NQO1、x CT、GPX4、TFR、FTH1、FTL蛋白表达情况。结果:1.动物实验:(1)在PM2.5诱导小鼠肺损伤模型中,PM2.5组小鼠肺组织HE染色显示肺泡壁受损,炎性细胞聚集在气道周围;PAS染色见支气管内粘液生成增多;支气管灌洗液(BALF)炎性因子IL-6、TNFα的升高。(2)在PM2.5诱导小鼠肺损伤模型中,PM2.5组小鼠的血清铁离子升高,DAB染色见铁沉积,肺组织MDA产生以及GSH消耗增加。(3)在PM2.5诱导小鼠肺损伤模型中,PM2.5组小鼠肺组织Nrf2及其下游HO-1和NQO1的表达被轻度激活,而x CT及GPX4的蛋白表达水平降低。(4)在PM2.5诱导小鼠肺损伤模型中,PM2.5组小鼠肺组织TFR、FTH1、FTL蛋白表达升高。(5)与WT组小鼠相比Nrf2-/-组小鼠出现更严重的炎症反应,表现为HE染色见肺泡壁受损更重,PAS染色见杯状细胞增生更明显,支气管灌洗液中炎性因子IL-6、TNFα的升高也更显著。(6)与WT组小鼠相比Nrf2-/-组小鼠出现更严重的铁离子蓄积以及铁代谢紊乱,表现为血清中铁离子升高更明显,DAB染色显示出更严重的铁沉积以及铁蛋白TFR、FTH1、FTL表达升高更显著。(7)与WT组小鼠相比Nrf2-/-组小鼠出现更严重的脂质过氧化,表现为更明显的MDA升高以及GSH消耗,x CT及GPX4的蛋白表达水平降低也更明显。2.细胞实验:(1)在PM2.5诱导的体外模型中,与正常BEAS-2B细胞相比Nrf2敲低的BEAS-2B细胞出现更严重的细胞死亡。(2)在PM2.5诱导的体外模型中,与正常BEAS-2B细胞相比Nrf2敲低的BEAS-2B细胞出现更明显的铁离子蓄积,ROS、MDA升高以及GSH的消耗。(3)在PM2.5诱导的体外模型中,与正常BEAS-2B细胞相比Nrf2敲低的BEAS-2B细胞Nrf2、HO-1、NQO1、x CT、GPX4表达减少更明显,而TFR、FTH1、FTL蛋白表达升高更明显。(4)在PM2.5诱导的体外模型中,与正常BEAS-2B细胞相比Nrf2激活的BEAS-2B细胞中Nrf2、HO-1、NQO1、x CT、GPX4的蛋白表达升高;细胞ROS、MDA的产生减少,细胞GSH的消耗减少。结论:PM2.5在体内及体外诱导铁死亡,Nrf2信号通路调控铁死亡,改善脂质过氧化,缓解PM2.5诱导的支气管上皮细胞死亡以小鼠肺组织损伤。