家蚕是一种具有重要经济价值的鳞翅目昆虫,由野蚕经人工驯化而来。栽桑养蚕起源于中国,据文献和出土文物的记载,蚕丝业在我国已有5000年历史,对世界产生了重大而深远的影响。然而蚕病每年给蚕桑产业造成近百亿元的经济损失,严重阻碍了整个蚕桑产业的发展。中肠是家蚕的一个重要免疫组织器官,很多病原是通过摄食被带入家蚕体内,中肠成为入侵的首要对象。然而很多中肠特异表达的基因在家蚕免疫方面具有重要的功能,要想通过转基因的方法来研究和利用这些中肠特异表达的基因,就需要一个中肠特异表达的启动子。　　 本研究的主要目的就是寻找并克隆家蚕中肠特异启动子。我们通过家蚕组织芯片表达数据和RT-PCR验证筛选出中肠特异表达候选基因,基于家蚕基因组数据库对候选基因的启动子区进行克隆,通过构建piggBac转基因表达载体在个体水平上验证了启动子的活性和组织特异性。获得的主要研究结果如下:　　 1.家蚕中肠特异表达基因的筛选　　 通过组织芯片数据的分析,我们筛选出在5龄第3天家蚕中肠特异高量表达的6个候选基因,对这些基因进行组织表达谱和时期表达谱分析,最终筛选出2个中肠特异表达基因分别为BGIBMGA008060和BGIBMGA014298。BGIBMGA008060是家蚕氨肽酶N(BmAPN)中的一员,是存在于幼虫中肠中能水解蛋白质或多肽N末端氨基酸的蛋白酶。BGIBMGA014298是保幼激素结合蛋白家族成员之一。　　 2.BmAPN启动子的克隆与活性检测　　 基于家蚕基因组数据,克隆了BmAPN基因5端侧翼区1598bp的调控序列,分析发现BmAPN启动子含有BmAPN基因的第1外显子、核心启动区域和5旁侧区,不包括第一内含子。以此序列为调控元件,构建成以绿色荧光蛋白EGFP为报告基因的piggyBac表达载体,经显微注射获得了转基因阳性个体。对两个转基因系统的插入位点分析表明BmAPN-EGFP表达框分别插入至家蚕基因组nscaf2952位置和15号染色体的nscaf2655位置;定量PCR和Westernblotting结果显示EGFP在转基因家蚕中肠中特异转录表达;其时期表达特征与内源基因BmAPN基本一致,随发育阶段的不同呈现有规律的变化,即幼虫期表达表达量相对较高,且起蚕中活性明显高于眠蚕中。提示BmAPN可能通过其启动子区的特异元件受激素的精确调控而行使功能。这是我们首次从家蚕大造品种中克隆出BmAPN启动子,通过构建以绿色荧光蛋白EGFP为报告基因的转基因表达载体,证实了BmAPN启动子具有较强的活性,且为中肠特异性启动子。为研究基因的表达调控和昆虫的抗病机制奠定了理论基础。　　 3.P2启动子驱动EGFP在转基因家蚕中的表达分析　　 克隆了BGIBMGA014298基因的上游调控序列1080bp,在线预测发现该序列具有典型的启动子结构,命名为P2。以P2为启动子、EGFP为报告基因构建了转基因表达载体pBac[P2-EGFP-SV40,3xP3DsRed],将此转基因表达载体通过显微注射的方式注射已解除滞育的大造早期胚胎,通过荧光筛选获得转基因系统。对获得的转基因系统进行反向PCR检测,来鉴定外源基因在基因组上的插入位置,结果显示2个转基因系统的P2-EGFP表达框分别插入到了家蚕第4号和23号染色体上。连续对转基因个体进行荧光观察,发现从4龄开始就能在幼虫体表观察到绿色荧光,将5龄第3天的转基因个体解剖后进行荧光观察,清晰的看到中肠部位发出强烈的绿色荧光,而其它组织则观察不到绿色荧光。对转基因阳性个体进行转录水平检测,结果表明P2启动子驱动EGFP在转基因家蚕中肠中特异高量表达,Westernblot蛋白水平检测的结果进一步验证P2启动子驱动绿色荧光蛋白的表达是中肠特异的,与荧光观察的结果是一致的。时期表达谱表明P2启动子驱动的EGFP在幼虫期表达量相对较高,且与内源基因的表达模式基本一致。