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第一部分:乌司他丁对TNF-α作用下EA.hy926细胞通透性的影响及相关机制的研究目的:探讨乌司他丁(UTI)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)所致血管内皮细胞通透性增加的影响及其主要的分子机制。方法:以TNF-α干预人脐静脉内皮细胞株EA.hy926,建立炎症刺激的细胞模型,用UTI干预EA.hy926细胞,构建Rho A过表达慢病毒,采用Transwell法、TEER法检测细胞通透性;免疫荧光法测肌球蛋白磷酸酶结合亚基1(p-MYPT1)的表达及细胞纤维肌动蛋白(F-actin)形态及分布;分别采用免疫细胞化学法、Western Blot法及q RT-PCR法检测与通透性相关的关键分子Rho A、Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶Ⅱ(ROCK2)、MYPT1、p-MYPT1及内皮血管钙黏蛋白(VE-cadherin)表达的变化情况。结果:1.TNF-α作用下EA.hy926单层细胞电阻值明显降低,细胞通透性显著升高(P<0.05),细胞内p-MYPT1的表达量较正常组明显增加,F-actin细胞骨架明显重新分布,细胞内应力纤维增多,VE-cadherin的表达量明显降低,而UTI可改善EA.hy926的上述变化情况;2.免疫细胞化学及Western Blot结果均显示,与正常对照组比较,TNF-α使Rho A、ROCK2的表达明显增加(均P<0.05),而UTI可抑制这两种蛋白的高表达;3.与未转染病毒细胞相比,UTI和TNF-α作用下,Rho A过表达使细胞内Rho A、ROCK2及p-MYPT1的表达显著增高,VE-cadherin表达降低,细胞通透性增加(均P<0.05);而空载对照病毒对Rho A、ROCK2、p-MYPT1和VE-cadherin的表达以及细胞通透性无明显影响(均P>0.05)。结论:UTI以剂量依赖性方式抑制TNF-α引起的EA.hy926细胞通透性增加,这一作用可能与Rho/ROCK信号通路有关。第二部分:乌司他丁对脂多糖诱导脓毒症小鼠肺损伤的保护作用及其可能机制目的:探讨乌司他丁(UTI)对脂多糖(LPS)诱导脓毒症小鼠肺损伤的保护作用及其可能机制。方法:1.将C57BL/6小鼠随机分为对照组(Con组,n=10)、模型组(LPS组,n=10)及UTI干预组(L+U组,n=30),建立LPS脓毒症小鼠模型;2.采用肺组织肺湿干重比(W/D)法及伊文思蓝染色(Evans Blue,EB)法观察各组小鼠肺组织含水量及肺微血管通透性的变化;3.HE染色法检测各组小鼠肺组织病理变化;4.免疫组化法检测肺组织VE-cadherin及ROCK2表达水平的变化。结果:1.与对照组比较,LPS组小鼠肺组织W/D及EB含量均显著增加(均P<0.05),而UTI干预组W/D及EB含量明显降低,其中UTI在104 U/kg、105 U/kg剂量时,与LPS组相比,有统计学差异(均P<0.05);2.与对照组小鼠肺组织相比,LPS组小鼠肺组织水肿,损伤严重,而UTI干预组肺组织损伤明显减轻;3.免疫组化结果显示,LPS组小鼠肺组织VE-cadherin的表达明显降低,ROCK2的表达明显增高(均P<0.05),而UTI干预后,VE-cadherin的表达显著增加,ROCK2的表达显著下降(均P<0.05)。结论:UTI以一定的剂量依赖性降低LPS所致的肺毛细血管通透性增加,从而改善脓毒症小鼠肺损伤,这一作用可能与UTI抑制Rho/ROCK信号通路的激活有关。