胰腺癌（Pancreatic cancer,PC）是恶性程度特高并且预后很差的消化道肿瘤,致死率极高,早期诊断困难,发现时大多已出现转移失去手术根治的机会。胰腺癌化疗耐药问题突出,其中胰腺癌间质成分多,深入研究胰腺癌间质成分在促进癌症发生发展中的作用和具体分子靶点具有重要意义。肿瘤微环境在癌症发生发展中的作用已被广泛证实。胰腺癌的肿瘤微环境中最显著的特点就是间质组织增生,其中最常见的细胞是肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts,CAFs）。CAFs在胰腺癌中异质性很高,根据功能可分为促癌型和抑癌型,无选择性地靶向CAFs会误伤抑癌型CAFs,从而对治疗胰腺癌的疗效产生影响。促癌型CAFs与抑癌型CAFs在一定条件下可以相互转化,因此,靶向介导CAFs促癌/抑癌表型转化的关键分子对精准靶向促癌CAFs有关键意义。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,Lnc RNA）是长度超过200个核苷酸并且不具备编码功能的RNA,在胰腺癌的致病机制中发挥关键作用。lnc RNA在介导CAFs与肿瘤细胞之间的细胞通讯中也有关键调控作用,研究胰腺癌CAFs中lnc RNA的表达情况和相关生物学功能为靶向胰腺癌间质组织的治疗手段提供新思路。m6A甲基化修饰是真核生物最常见的表观遗传学修饰之一,近来发现在胰腺癌中m6A甲基化关键调节因子和m6A甲基化修饰水平在胰腺癌组织和细胞中有显著变化,但在胰腺癌间质成分和肿瘤相关成纤维细胞中的研究极少。METTL3作为m6A甲基化修饰最核心的调节基因,相关研究发现METTL3具有促癌作用,但METTL3在CAFs中的表达水平和生物学意义尚未阐明。lnc RNA上同样有m6A修饰,并且对lnc RNA的生成、转录、降解等过程有调控作用。研究METTL3如何通过m6A甲基化修饰调控下游lnc RNA的表达对甲基化修饰在胰腺癌CAFs中的作用机制和靶点分子提供新思路。本课题中,我们首先通过分离提取和鉴定胰腺癌CAFs,通过与胰腺癌细胞共培养鉴定CAFs的功能分型。选择促癌型CAFs与胰腺癌细胞共培养,经过细胞增殖实验筛选出METTL3在维持CAFs促癌表型中有关键作用并且通过体外和体内实验验证。在组织芯片中对胰腺癌组织进行免疫荧光染色,发现METTL3在胰腺癌间质中有显著表达,并且表达量随着肿瘤分级升高而增加。对胰腺癌CAFs进行m6A测序和转录组测序发现,METTL3在CAFs中通过m6A甲基化修饰水平调控下游lnc RNA分子MALAT1的表达。基因集富集分析结果显示METTL3在CAFs中通过IL-6/STAT3通路发挥促癌作用。MALAT1在CAFs中能够调节IL-6的表达和分泌。通过以上研究结果,提示胰腺癌CAFs中METTL3在CAFs中介导的维持促癌表型的作用和具体的调控作用机制,为今后精准靶向胰腺癌间质CAFs的治疗方向提供新思路。第一部分:METTL3在胰腺癌相关成纤维细胞维持促癌表型中的作用及其临床意义目的:研究METTL3在胰腺癌间质组织和成纤维细胞中的表达情况,通过胰腺癌病人的组织芯片分析METTL3在间质组织中表达的临床意义,通过体外和体内实验探究METTL3在CAFs中维持促癌表型的作用。方法:分离、鉴定胰腺癌原代CAFs,将其与胰腺癌细胞共培养后确定是否具有促癌表型,选取具有促癌作用的CAFs进行研究。通过对胰腺癌组织芯片（90例）的多色原位杂交染色和临床标本的免疫组化染色,比较胰腺癌组织,间质组织和癌旁组织中METTL3的表达差异,并且统计分析90例临床胰腺癌患者肿瘤间质组织中METTL3的表达量与患者临床病理特征参数的相关性。采用CAFs细胞与胰腺癌细胞共培养的体外实验和体内裸鼠皮下瘤接种的实验方法研究METTL3在CAFs维持促进癌细胞增殖表型中的作用。结果:组织芯片多色原位杂交染色和临床标本的免疫组织化学染色结果均表明METTL3在胰腺癌肿瘤间质组织中的表达量高于癌旁组织。胰腺癌患者肿瘤间质组织中METTL3的表达量与患者的临床病理特征参数的统计分析结果表明,METTL3在肿瘤间质组织中的表达与胰腺癌的病理分级相关。体外和体内实验均证明METTL3具有维持CAFs促癌增殖表型的作用。结论:METTL3在胰腺癌间质组织和肿瘤相关成纤维细胞中表达。METTL3在胰腺癌相关成纤维细胞维持促癌表型中起关键作用。第二部分:METTL3在胰腺癌相关成纤维细胞中通过IL-6/STAT3通路维持促癌表型目的:探究METTL3在CAFs中通过何种信号通路维持促癌表型。方法:对CAFs中下调METTL3表达的转录组测序结果进行GSEA分析,找出METTL3在CAFs中影响最明显的信号通路。通过细胞因子蛋白芯片分别检测敲减METTL3表达后的CAFs与NFs细胞上清进行比较并筛选出在CAFs中敲减METTL3表达后变化最明显的细胞因子,并通过实时荧光定量PCR和ELISA法进行验证。将筛选出的细胞因子刺激胰腺癌细胞,观察其是否对胰腺癌的增殖表型有促进作用。结果:GSEA分析结果显示CAFs中敲减METTL3表达后下调最明显的通路是炎症相关通路,其中IL-6/JAK/STAT3通路下调最明显。一些胰腺癌相关的通路也有显著下调。实时荧光定量PCR显示IL-6/JAK/STAT3通路中的关键炎症因子IL-6、LIF的m RNA表达水平显著下降。细胞因子蛋白芯片分析得出在CAFs中下调METTL3后表达量大于300并且下降最明显的细胞因子是IL-6,而在NFs中IL-6的表达水平在下调METTL3表达后发生上升。ELISA实验验证了CAFs上清中IL-6的变化水平与芯片结果一致。共培养实验表明CAFs CM和外源性IL-6能刺激胰腺癌细胞的磷酸化STAT3表达和胰腺癌细胞的增殖能力,并且这一促进作用能被IL-6中和抗体所抑制。结论:胰腺癌CAFs中METTL3通过IL-6/STAT3信号通路发挥促癌功能。胰腺癌CAFs CM中的IL-6能够激活胰腺癌细胞的STAT3通路和增殖能力。第三部分:胰腺癌相关成纤维细胞中METTL3通过调控MALAT1表达发挥促癌作用目的:探究METTL3在CAFs细胞中发挥促癌作用的下游分子机制。方法:对促癌型CAFs细胞系敲减METTL3表达后进行m6A测序和转录组测序（包括m RNA和lnc RNA）,通过联合两种测序结果筛选出敲减METTL3表达后m RNA水平和m6A甲基化修饰水平均下降的lnc RNA分子。采用Me RIP-PCR和RNA稳定性实验验证METTL3是否通过m6A修饰调节筛选出的lnc RNA分子的稳定性和表达。通过TCGA和GEO公共数据库分析METTL3与筛选出的lnc RNA是否具有相关性。体外和体内实验探究METTL3在CAFs中是否通过维持筛选出的lnc RNA分子的表达介导其促癌表型。通过m6A蛋白印迹实验观察CAFs中敲减METTL3表达后是否会影响自身总体甲基化水平。通过原位杂交染色方法检测上述筛选出的lnc RNA分子在胰腺癌间质组织和成纤维细胞中是否有表达。在CAFs中过表达或敲减该lnc RNA分子的表达后,通过不同处理后的CAFs与胰腺癌细胞共培养,随后实验观察胰腺癌细胞的增殖能力和克隆形成能力,观察该分子表达对CAFs促进胰腺癌细胞增殖的表型有无影响。通过实时荧光定量PCR和ELISA实验研究CAFs中lnc RNA分子的表达是否会影响细胞自身和分泌的IL-6水平。结果:在CAFs中将METTL3敲减后进行m6A测序,m6A甲基化蛋白印迹实验验证了CAFs中下调METTL3表达后总体甲基化水平明显下降。m6A测序结果显示甲基化修饰位点在m RNA上的位置分布主要是在3’UTR区,其次是CDS区,分布最少的是5’UTR区域。联合第二部分转录组测序结果筛选出下调METTL3表达后MALAT1的m RNA水平和m6A甲基化水平均显著下降。Me RIPPCR和RNA稳定性实验验证了METTL3在CAFs中通过增强m6A甲基化修饰从而加强MALAT1的稳定性,促进MALAT1的表达。对公共数据库TCGA和GEO中的数据集进行分析,结果发现METTL3与MALAT1的相关性在多个数据集中呈正相关性。MALAT1在胰腺癌间质组织和癌相关成纤维细胞中表达。CCK8和平板克隆形成实验显示CAFs中过表达MALAT1后其促进胰腺癌细胞增殖的能力提升,而下调MALAT1在CAFs中的表达后其促进胰腺癌细胞增殖的能力受到抑制。CAFs中MALAT1过表达会促进自身IL-6的表达和分泌,而降低MALAT1水平则抑制自身IL-6的表达和分泌。体外细胞实验和体内裸鼠皮下瘤实验均证明,MALAT1参与介导了METTL3在CAFs细胞中对胰腺癌细胞的促进增殖的作用。结论:METTL3在CAFs中通过m6A修饰水平调控MALAT1的表达。MALAT1在胰腺癌间质细胞中表达,并在胰腺癌CAFs中发挥促癌作用。胰腺癌CAFs中MALAT1能够调控自身及分泌的炎症因子IL-6的表达,METTL3在促癌型CAFs中通过MALAT1的表达介导自身促癌表型的维持。