论文部分内容阅读
第Ⅰ部分：
番荔枝酰胺衍生物FLZ对高同型半胱氨酸所致大鼠脑微血管内皮细胞损伤的保护作用
同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一种含巯基的非必需氨基酸，是甲硫氨酸代谢的中间产物。研究发现，血浆中Hcy水平升高是动脉粥样硬化等心血管疾病的独立风险因子。高Hcy引起脉管系统中氧化应激增强是内皮细胞功能障碍的一个关键因素，活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)生成增加在Hcy诱导的内皮功能失调、血管损伤和动脉粥样硬化的发病中起着关键作用。此外，高Hcy使血管氧化应激升高可激活内皮细胞中促炎症反应信号途径，导致内皮细胞表达趋化因子和粘附分子增加，还可激活内皮细胞的凋亡信号，促进细胞凋亡。
FLZ是人工全合成的番荔枝酰胺类新化合物，含有多个酚羟基，已经证实FLZ具有很强的抗氧化和抗凋亡作用，对多种AD、PD动物模型和细胞模型以及大鼠缺血再灌注模型都有明显的保护作用，但对内皮细胞是否有保护作用尚未进行过相关的研究。本课题在Hcy致原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞(rat brain microvascular、endothelial cells，rBMECs)损伤的模型上评价了FLZ的保护作用，并对其可能机制进行了探讨。
用FLZ与rBMECs共孵育1h后，加入Hcy继续孵育24h，观察FLZ对内皮细胞的保护作用。结果显示：(1)1mM Hcy孵育rBMECs24h后对细胞有明显的毒性，MTT法检测结果显示细胞存活率下降至55％;(2)MTT法结果表明FLZ(0.1，1，10μM)可浓度依赖性的提高Hcy损伤rBMECs后的细胞存活率，Hoechst33342染色法显示FLZ可降低Hcy引起的细胞核内呈致密浓染颗粒状荧光的细胞数；(3)免疫细胞染色法显示FLZ可浓度依赖性的抑制胞内SA-β-ga1的活性；(3)DCFDA荧光法显示FLZ可浓度依赖性的抑制Hcy引起的胞内氧化应激的增强；(5)Westernblotting法显示FLZ可浓度依赖性的减少细胞核内核转录因子κB(Nuclear Factor，NF-κB)的蛋白含量，增加胞浆中NF-κB的含量，还可抑制Hcy引起的死亡受体Fas表达的增加；(6)Western blotting法显示FLZ可浓度依赖性抑制凋亡相关蛋白p53和Noxa的表达，减少线粒体Cytc的释放。
以上结果提示FLZ对Hcy引起的内皮细胞损伤有显著的保护作用，作用机制显示FLZ可其降低胞内氧化应激，通过两条途径抑制细胞凋亡，一方面抑制Hcy诱导的NF-κB激活，进而抑制细胞膜死亡受体Fas表达上调，抑制外源性凋亡途径；另一方面抑制Hcy诱导的p53、Noxa高表达引起的线粒体Cytc的释放，进而抑制内源性凋亡途径。我们推测FLZ可能对Hcy相关的心血管疾病有一定的保护作用，但尚需进一步的研究。
第Ⅱ部分：
N6-取代腺苷衍生物B2镇静催眠作用机制研究
天麻是一种具有镇静催眠、抗惊厥、镇静、促智、抗衰老和心血管保护作用的传统中药，我们与中国医学科学院药物研究所植化室石建功教授合作，首次从天麻中分离得到了一种N6-取代腺苷衍生物NHBA，并证实其可能是天麻镇静催眠作用的物质基础。由于NHBA的口服利用度很低，以NHBA为先导化合物进行结构修饰，获得了一个新化合物B2。我们实验室已确证了B2有很强的镇静催眠作用，本研究旨在进一步研究B2的镇静催眠机制。
1．我们用大鼠、小鼠脑匀浆和稳定转染人腺苷受体的CHO细胞进行了亲和力的测定。结果表明B2与小鼠、大鼠、人A1R的Ki值分别为0.19μM、0.21μM、3.02μM;与小鼠、大鼠、人A2AR的Ki值分别为0.30μM、0.43μM、1.54μM。提示B2与大鼠和小鼠的腺苷受体亲和力相当，但与人腺苷受体亲和较小。
我们在稳定表达人源腺苷A1或A2A受体的CHO细胞上评价了B2对A1和A2A受体的内在活性。结果表明，B2对A1R/A2AR均有激功作用，B2对A1RJA2AR的EC50分别为0.18μM/0.32μM。
2．GABA是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，腹腔给予小鼠B2(5mg/kg，i.p.)，可使小鼠下丘脑和皮层中GABA水平显著升高(分别升高39%和22%)，使下丘脑和丘脑谷氨酸水平显著下降（分别下降26%和11%）。脑内GABA是在GAD的作用下由谷氨酸脱羧产生，由B2对小鼠各脑区组织中谷氨酸和GABA水平的影响推测B2可能有激活GAD的作用，从而引起脑组织中谷氨酸降低，GABA升高。小鼠腹腔注射GAD抑制剂盐酸氨基脲(100mg/kg，i.p.)对戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠潜伏期和睡H民时间无明显影响，但能明显抑制B2（2.5mg/kg和5.0mg/kg，i.p.）对小鼠的睡眠延长作用，提示B2可能增加脑内GABA的含量可能与激活GAD有关。
下丘脑后部TMN区是觉醒相关区域，在此基础上，我们用微透析的方法测定了B2对大鼠TMN区细胞间隙GABA水平的影响。结果显示，大鼠腹腔注射40mg/kgB2后可引起TMN区细胞外GABA水平升高，是基础值的2倍。
3．单胺类递质NE、DA和5-HT均参与了睡眠．觉醒的调节。我们用HPLC-EC法检测了B2对小鼠各脑区组织中NE、DA和5-HT单胺类神经递质的影响。结果表明，B2(5mg/kg，i.p.)可明显降低小鼠丘脑、脑干和下丘脑匀浆中NE含量（分别降低27%、20%和19%）；显著降低下丘脑、纹状体、丘脑匀浆中DA含量（分别下降38%、33%和18%）；使下丘脑、纹状体、丘脑和脑干组织中5-HT水平显著下降（分别下降46%、37%、26%和21%）。
结果：提示，B2引起各脑区中促觉醒单胺类递质NE、DA和5-HT水平的下降可能也是其发挥镇静催眠作用的机制之一。
4．用HPLC-UV法检测了B2对小鼠各脑区腺苷及其代谢产物肌苷水平的影响。结果表明，B2对小鼠各脑区腺苷水平均有显著降低，而肌苷水平相应升高。
5．PPT位于脑桥背外侧，在调节REM和觉醒中起重要作用，PPT区胞内pCaMKⅡ激活可能是调节觉醒的一个重要的胞内信号机制。PPT区pCaMKⅡ表达水平与W总时间正相关，睡眠总时间负相关。大鼠腹腔注射B2(40mg/kg)2h后可引起大鼠PPT区pCaMⅡ水平表达显著下降，推测B2抑制PPT区CaMKⅡ活性可能是其镇静催眠的作用机制之一。