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第一部分人Lefty-A基因RNAi慢病毒载体的构建及验证
目的构建人LEFTY-A基因RNA干扰(RNAi)序列的慢病毒载体并在工具细胞(人肾小管上皮细胞HK-2)中验证其对LEFTY-A基因的敲减效率。
方法针对人LEFTY-A基因(NM_003240)设计两条RNAi序列，设计并合成其siRNA的DNAOligo，经退火形成双链DNA后，运用T4噬菌体DNA连接酶与经AgeⅠ和EcoRI双酶切后的pGCSIL-GFP连接，转化感受态细胞。使用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增检测阳性菌落，挑选阳性克隆菌液进行测序分析。选择测序鉴定正确的克隆，抽提pGCSIL-GFP质粒(分别命名为PgcSIL1、PgcSIL2)，同时抽提pHelper1.0和pHelper2.0质粒。用Lipofectamine2000将二种质粒共转染293T细胞进行慢病毒包装，获得的病毒浓缩液采用逐孔稀释滴度测定法进行病毒生物学滴度测定。用构建的四种LEFTY-ARNAi慢病毒载体感染HK-2细胞分别设为KD1组和KD2组，阴性对照慢病毒感染的HK-2细胞设为NC组，CON为未感染病毒的细胞组。使用RT-PCR方法检验在不同的感染复数(MOI为5或10)下两种LEFTY-ARNAi慢病毒载体的干扰效率。选择敲减效率最高的siRNA序列进行慢病毒大包装。
结果经293T细胞包装后获得两种LEFTY-ARNAi的慢病毒载体，分别命名为Pgcsil1和Pgcsil2，其各自的终浓度分别是1×108TU/ml和1×108TU/ml。RT-PCR检测结果显示，低MOI值时(MO1=5)，CON组、NC组、KD1组和KD2组的2-△△Ct值分别是0.929±0.063、1.011±0.143、0.011±0.001和0.035±0.009。各-KD组和NC组比较，tKD1-NC=12.16，tkD2-NC=11.83，p值均小于0.01;各KD组和CON组比较，tKD1-CON=25.25，tKD2-CON=24.33，p值也部小于0.01；而CON组与NC组比较，tcon-NC=0.906，p值大于0.05，差异没有显著性。高MOI值时(MOI=10)，CON组、NC组、KD1组和KD2组的2-△△Ct值分别是0.965±0.104、1.016±0.178、0.009±0.002和0.008±0.001。各KD组和NC组比较，tKD1-NC=9.83，tKD2-NC=9.83，p值均小于0.01；各KD组和CON组比较，tKD1-CON=15.99，tKD2-CON=16.02，p值也都小于0.01；而CON组与NC组比较，tcon-NC=0.43，p值大于0.05，差异没有显著性。因此两个构建的慢病毒载体中Pgcsil1在HK-2细胞上对LEFTY-A基因的表达都有非常显著的敲减效果，敲减效率均达到95%以上；Pgcsil2的敲减效率也达到90%以上。故选择Pgcsil1的siRNA序列进行慢病毒大包装，包装后病毒的终浓度为1×109TU/ml。
结论本实验成功构建了LEFTY-ARNAi慢病毒载体Pscsil1，能表达由CMV启动子驱动的荧光蛋白GFP，有助于帮助判断感染效率；可用来建立稳定表达LEFTY-A基因敲减的细胞株；在HK-2细胞中对LEFTY-A基因的表达有很高的敲减效率。因此该LEFTY-ARNAi慢病毒载体能够有效沉默细胞内LEFTY-A基因的表达，为进一步研究LEFTY-A基因对器官纤维化的作用奠定了基础。
第二部分LeftyA-RNAi增强TGF-β1的EMT诱导作用
目的利用LEFTY-A-RNAi慢病毒载体感染人肾小管上皮(HK-2)绌胞，并探讨LEFTY-A基因表达受抑制后对其对TGF-β1刺激而发生EMT效应。
方法将实验HK-2细胞随机分成4组，TGF-β1干预组(10ng/ml，T)，TGF-β1+Pgcsil1慢病毒感染组(10ng/ml,T+P)，Pgcsil1慢病毒感染组(Pgcsil1 transfection，P)，单纯HK-2细胞培养组(Normal HK-2 cell line，N)。检测构建的病毒载体对该细胞LEFTY-A基因表达的敲减效率。所有Pgcsil1感染组细胞均于感染36h后，换用DMEM-F12(含双抗)培养，同时给予TGF-β1(T+P组)或同体积的无菌生理盐水(P组)进行干预。所有组分别于干预后12、24、48h收集细胞，部分提取细胞总蛋白，部分提取总RNA，-70℃保存。Western-blot法检测HK-2细胞中Lefty-A、α-SMA、CTGF蛋白的表达水平。RT-PCR法检测培养HK-2细胞中Lefty-A、α-SMA、CTGFmRNA的表达。ELISA法检测细胞上清液中Col-Ⅰ的表达。
结果重组Lefty-ARNAi慢病毒载体可显著降低HK-2细胞Lefty-AmRNA和蛋白的表达。两次RT-PCR结果均显示，KD组的mRNA表达只有NC组的15%左右，实验一：与NC组(1.00±0.04)和CON组(0.99±0.10)比较，KD组(0.18±0.04)Lefty-AmRNA的表达下降显著(tKD/NC=28.07，P＜0.01；tKD/CON=12.70，P＜0.01)，而NC组与CON组相比较差异无统计学意义(tCON/NC=0.17，P＞0.05)；实验二：与NC组(1.02±0.25)和CON组(0.91±0.14)比较，KD组(0.11±0.04)Lefty-AmRNA的表达下降显著(tKD/NC=6.19，P＜0.05；tKD/CON=9.57，P＜0.01)；而NC组与CON组相比较差异无统计学意义(tCON/NC=0.70，P＞0.05)。在各组蛋白上样量相同的条件下，KD组(0.33±0.13)Lefty-A蛋白表达只有NC组(1.82±0.18)的18％(t=11.63，P＜0.01);KD组蛋白表达与CON组(1.79±0.15)比较也下降显著(t=12.72，P＜0.01)；而CON组与NC组比较，差异无显著性(t=0.19，P＞0.05)。经TGF-β1刺激12h后，正常HK-2细胞中，α-SMA蛋白几乎没有表达；T组可见胞浆中α-SMA和CTGF表达上调，但CTGF表达量的比较中P值＞0.05;T+P组细胞中α-SMA(P＜0.05)、CTGF(P＜0.05)蛋白的表达均明显升高；P组细胞两蛋白的表达与正常比较未见变化。到24h时，T组胞浆中α-SMA(P＜0.05)与CTGF(P＜0.05)蛋白表达继续上调，而T+P组的上调幅度更大，而P组蛋白表达与正常比较仍无明显变化。到48h时，T+P组胞浆中α-SMA(P＜0.01)和CTGF(P＜0.01)的表达量已远远高于T组；与P组或N组比较差异仍具有显著性意义。RT-PCR结果显示，α-SMA、CTGFmRNA的表达基本与各自蛋白表达的变化趋势一致。P组或N组中两基因的表达在三个时间点均无明显变化。而T组和T+P组中两基因的表达均高于P组和正常对照。并随时间的延长，T+P组中α-SMA、CTGFmRNA的表达水平与T组的差异逐渐增大。ELISA检测结果显示，P组或N组HK-2细胞培养上清液中Col-Ⅰ的含量基本在三个观察时间点均无明显变化。在个时间点T+P组和T组的测量值均显著高于P组或N组。而主要差异变化体现在T+P组和T组之间，随RNA干扰时间的延长，T+P组上清液中Col-Ⅰ的水平与T组的差异逐渐增大。
结论构建的介导LEFTYRNAi的慢病毒载体在HK-2细胞中具有较好的干扰效果。而LEFTY-A基因表达被干扰后，HK-2细胞对TGF-β1刺激的反应显著增强，细胞表达α-SMA蛋白而发生EMT的速度明显增快。反证了Lefty-A在纤维化产生过程中的关键作用。所以，通过慢病毒载体介导的RNAi可在体外有效降低HK-2细胞LEFTY-A基因的表达，这种LEFTY-A基因和蛋白的强制低表达增强了HK-2细胞在体外对于TGF-β1刺激的反应，加快了细胞发生EMT的进程，促进了纤维化的发生。
目的构建人LEFTY-A基因RNA干扰(RNAi)序列的慢病毒载体并在工具细胞(人肾小管上皮细胞HK-2)中验证其对LEFTY-A基因的敲减效率。
方法针对人LEFTY-A基因(NM_003240)设计两条RNAi序列，设计并合成其siRNA的DNAOligo，经退火形成双链DNA后，运用T4噬菌体DNA连接酶与经AgeⅠ和EcoRI双酶切后的pGCSIL-GFP连接，转化感受态细胞。使用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增检测阳性菌落，挑选阳性克隆菌液进行测序分析。选择测序鉴定正确的克隆，抽提pGCSIL-GFP质粒(分别命名为PgcSIL1、PgcSIL2)，同时抽提pHelper1.0和pHelper2.0质粒。用Lipofectamine2000将二种质粒共转染293T细胞进行慢病毒包装，获得的病毒浓缩液采用逐孔稀释滴度测定法进行病毒生物学滴度测定。用构建的四种LEFTY-ARNAi慢病毒载体感染HK-2细胞分别设为KD1组和KD2组，阴性对照慢病毒感染的HK-2细胞设为NC组，CON为未感染病毒的细胞组。使用RT-PCR方法检验在不同的感染复数(MOI为5或10)下两种LEFTY-ARNAi慢病毒载体的干扰效率。选择敲减效率最高的siRNA序列进行慢病毒大包装。
结果经293T细胞包装后获得两种LEFTY-ARNAi的慢病毒载体，分别命名为Pgcsil1和Pgcsil2，其各自的终浓度分别是1×108TU/ml和1×108TU/ml。RT-PCR检测结果显示，低MOI值时(MO1=5)，CON组、NC组、KD1组和KD2组的2-△△Ct值分别是0.929±0.063、1.011±0.143、0.011±0.001和0.035±0.009。各-KD组和NC组比较，tKD1-NC=12.16，tkD2-NC=11.83，p值均小于0.01;各KD组和CON组比较，tKD1-CON=25.25，tKD2-CON=24.33，p值也部小于0.01；而CON组与NC组比较，tcon-NC=0.906，p值大于0.05，差异没有显著性。高MOI值时(MOI=10)，CON组、NC组、KD1组和KD2组的2-△△Ct值分别是0.965±0.104、1.016±0.178、0.009±0.002和0.008±0.001。各KD组和NC组比较，tKD1-NC=9.83，tKD2-NC=9.83，p值均小于0.01；各KD组和CON组比较，tKD1-CON=15.99，tKD2-CON=16.02，p值也都小于0.01；而CON组与NC组比较，tcon-NC=0.43，p值大于0.05，差异没有显著性。因此两个构建的慢病毒载体中Pgcsil1在HK-2细胞上对LEFTY-A基因的表达都有非常显著的敲减效果，敲减效率均达到95%以上；Pgcsil2的敲减效率也达到90%以上。故选择Pgcsil1的siRNA序列进行慢病毒大包装，包装后病毒的终浓度为1×109TU/ml。
结论本实验成功构建了LEFTY-ARNAi慢病毒载体Pscsil1，能表达由CMV启动子驱动的荧光蛋白GFP，有助于帮助判断感染效率；可用来建立稳定表达LEFTY-A基因敲减的细胞株；在HK-2细胞中对LEFTY-A基因的表达有很高的敲减效率。因此该LEFTY-ARNAi慢病毒载体能够有效沉默细胞内LEFTY-A基因的表达，为进一步研究LEFTY-A基因对器官纤维化的作用奠定了基础。
第二部分LeftyA-RNAi增强TGF-β1的EMT诱导作用
目的利用LEFTY-A-RNAi慢病毒载体感染人肾小管上皮(HK-2)绌胞，并探讨LEFTY-A基因表达受抑制后对其对TGF-β1刺激而发生EMT效应。
方法将实验HK-2细胞随机分成4组，TGF-β1干预组(10ng/ml，T)，TGF-β1+Pgcsil1慢病毒感染组(10ng/ml,T+P)，Pgcsil1慢病毒感染组(Pgcsil1 transfection，P)，单纯HK-2细胞培养组(Normal HK-2 cell line，N)。检测构建的病毒载体对该细胞LEFTY-A基因表达的敲减效率。所有Pgcsil1感染组细胞均于感染36h后，换用DMEM-F12(含双抗)培养，同时给予TGF-β1(T+P组)或同体积的无菌生理盐水(P组)进行干预。所有组分别于干预后12、24、48h收集细胞，部分提取细胞总蛋白，部分提取总RNA，-70℃保存。Western-blot法检测HK-2细胞中Lefty-A、α-SMA、CTGF蛋白的表达水平。RT-PCR法检测培养HK-2细胞中Lefty-A、α-SMA、CTGFmRNA的表达。ELISA法检测细胞上清液中Col-Ⅰ的表达。
结果重组Lefty-ARNAi慢病毒载体可显著降低HK-2细胞Lefty-AmRNA和蛋白的表达。两次RT-PCR结果均显示，KD组的mRNA表达只有NC组的15%左右，实验一：与NC组(1.00±0.04)和CON组(0.99±0.10)比较，KD组(0.18±0.04)Lefty-AmRNA的表达下降显著(tKD/NC=28.07，P＜0.01；tKD/CON=12.70，P＜0.01)，而NC组与CON组相比较差异无统计学意义(tCON/NC=0.17，P＞0.05)；实验二：与NC组(1.02±0.25)和CON组(0.91±0.14)比较，KD组(0.11±0.04)Lefty-AmRNA的表达下降显著(tKD/NC=6.19，P＜0.05；tKD/CON=9.57，P＜0.01)；而NC组与CON组相比较差异无统计学意义(tCON/NC=0.70，P＞0.05)。在各组蛋白上样量相同的条件下，KD组(0.33±0.13)Lefty-A蛋白表达只有NC组(1.82±0.18)的18％(t=11.63，P＜0.01);KD组蛋白表达与CON组(1.79±0.15)比较也下降显著(t=12.72，P＜0.01)；而CON组与NC组比较，差异无显著性(t=0.19，P＞0.05)。经TGF-β1刺激12h后，正常HK-2细胞中，α-SMA蛋白几乎没有表达；T组可见胞浆中α-SMA和CTGF表达上调，但CTGF表达量的比较中P值＞0.05;T+P组细胞中α-SMA(P＜0.05)、CTGF(P＜0.05)蛋白的表达均明显升高；P组细胞两蛋白的表达与正常比较未见变化。到24h时，T组胞浆中α-SMA(P＜0.05)与CTGF(P＜0.05)蛋白表达继续上调，而T+P组的上调幅度更大，而P组蛋白表达与正常比较仍无明显变化。到48h时，T+P组胞浆中α-SMA(P＜0.01)和CTGF(P＜0.01)的表达量已远远高于T组；与P组或N组比较差异仍具有显著性意义。RT-PCR结果显示，α-SMA、CTGFmRNA的表达基本与各自蛋白表达的变化趋势一致。P组或N组中两基因的表达在三个时间点均无明显变化。而T组和T+P组中两基因的表达均高于P组和正常对照。并随时间的延长，T+P组中α-SMA、CTGFmRNA的表达水平与T组的差异逐渐增大。ELISA检测结果显示，P组或N组HK-2细胞培养上清液中Col-Ⅰ的含量基本在三个观察时间点均无明显变化。在个时间点T+P组和T组的测量值均显著高于P组或N组。而主要差异变化体现在T+P组和T组之间，随RNA干扰时间的延长，T+P组上清液中Col-Ⅰ的水平与T组的差异逐渐增大。
结论构建的介导LEFTYRNAi的慢病毒载体在HK-2细胞中具有较好的干扰效果。而LEFTY-A基因表达被干扰后，HK-2细胞对TGF-β1刺激的反应显著增强，细胞表达α-SMA蛋白而发生EMT的速度明显增快。反证了Lefty-A在纤维化产生过程中的关键作用。所以，通过慢病毒载体介导的RNAi可在体外有效降低HK-2细胞LEFTY-A基因的表达，这种LEFTY-A基因和蛋白的强制低表达增强了HK-2细胞在体外对于TGF-β1刺激的反应，加快了细胞发生EMT的进程，促进了纤维化的发生。