Synechocystis sp. PCC 6803中AP-B功能、结构研究及ApcE与非光化学淬灭和状态转换关系的研究

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蓝藻拥有一个特殊的捕获光能的元件:藻胆体(Phycobilisome,PBS)。蓝藻的藻胆体有两个终端能量发射器,别藻蓝蛋白B(Allophycocyanin B,AP-B)和核膜连接蛋白(core-membrane linker,LCM)。终端能量发射器作为蓝藻特殊的捕光复合体,其低能级激发水平与相应红移的吸收和荧光发射光谱在将激发能从藻胆体膜上的数百计生色团汇聚到光合作用膜反应中心起着非常重要的作用。藻胆体的AP-B是由α亚基(ApcD)和β亚基(ApcB)组成,其含量非常少,通过体外重组后,在大肠杆菌中表达的蛋白,纯化后又不能结晶,所以一直没有AP-B的晶体结构,而其光谱极端红移和能量方向性转移机制仍不清楚。本研究中,我们首先是在apc D的C端加上His标签,构建了ApcD-His6的诱变藻,进而从Synechocystis sp.PCC 6803中提取AP-B的复合物并进行结晶,最终得到了其三聚物(ApcD-ApcB)3的晶体结构,分辨率是1.75?。AP-B的晶体结构显示,与其α亚基(ApcD)结合的藻蓝胆素(Phycocyanobilin,PCB)的周围有一些体积庞大的氨基酸残基,这些氨基酸残基对PCB不断的挤压,并且通过与其邻近的β亚基(ApcB)的相互作用,使得与α亚基(ApcD)结合的PCB的B、C和D环是几乎完全在一个平面上,形成共轭平面体系,我们认为此共轭平面体系是AP-B中Apc D生色团吸收(669 nm)和荧光发射(679 nm)红移的结构基础,也是促使激发能由藻胆体核高效的传递到光系统(Photosystem)的前提。AP-B晶体结构高度对称,空间群是I432,此晶体结构有助于藻胆蛋白生物分子元件设计的研究。藻胆体(PBS)主要作为光系统Ⅱ(Photosystem Ⅱ,PSⅡ)的捕光器,由藻胆蛋白组成,负责向光系统Ⅱ(PSⅡ)传递能量。蓝藻作为一种光合生物,存在很多的光保护机制,主要有:蓝光诱导的非光化学淬灭(Non-photochemical quenching,NPQ)和状态转换(state transition)。对于状态转换,很多研究者认为是藻胆体在类囊体膜上移动来调节能量在光系统上的分配,但目前仍不了解状态转换的具体机理。对于蓝光诱导的NPQ,目前的研究表明其是在高蓝光条件下,活性橙色胡萝卜蛋白(Orange carotenoid protein,OCP)与藻胆体相互作用,增加热耗散,来保护其光系统不受损伤。但是我们并不清楚OCP与藻胆体的具体结合位点。由于ApcE同时连接着藻胆体和类囊体膜,不仅参与藻胆体的组装而且也决定了藻胆体核结构的大小。我们根据ApcE结构与功能的特点,利用插入失活的方法,分别缺失了ApcE的第3个重复序列(Repeat3,简称Rep3)、第2个手臂序列(Arm2)以及同时缺失Arm2和Rep3,成功得到了Δ(rep3)、Δ(arm2)和Δ(arm2/rep3)的缺失体,并分析了这些缺失体的生理活性、光谱特性、NPQ和状态转换等数据。我们的实验结果表明,在Δ(rep3)这个缺失体中同时存在非光化学淬灭(NPQ)和状态转换,并且这两个圆柱筒是位于藻胆体的底部;而在Δ(arm2)和Δ(arm2/rep3)这两个缺失体中只存在NPQ,而没有明显的状态转换。因此,我们根据这些实验结果推断:Arm2与蓝藻的状态转换有关而与NPQ没有关系,同时NPQ是与藻胆体核基部的两个圆柱筒(cylinder 1和cylinder 2)有关。这一发现对未来能够清晰阐明蓝藻的光保护机制作出了贡献。
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