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龙眼（Dimocarpus longan Lour.）属无患子科(Sapindaceae)龙眼属,是著名的热带亚热带特色果树。龙眼体细胞胚胎发生（ somatic embryogenesis, SE）系统是研究龙眼胚胎发育的良好系统。长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）参与可变切割、转录干扰、DNA甲基化调节和蛋白质修饰，但对于lncRNAs在植物体胚发生过程中的研究还未见报道。在本研究中，以胚性愈伤组织(embryonic callus， EC)、不完全胚性紧实结构（Incomplete embryonic compact structure， ICpEC）、球形胚（globular embryo，GE）为试验材料，采用Illumina HiSeq测序技术系统地鉴定了龙眼体胚发生早期3个阶段的lncRNAs；对lncRNAs的差异显著性分析结果，进行筛选及表达分析；通过KEGG富集分析，构建生长素、脱落酸与乙烯响应因子相关的lncRNAs调控网络，进行龙眼SE早期以及在相应激素处理下的表达分析，并对lncRNAs靶基因ERF相关的家族成员进行鉴定；预测lncRNAs与miRNA的作用关系网络，通过miRNA的过表达与抑制表达处理，使用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR）技术对其相关的lncRNAs与mRNAs进行表达量验证；构建lncRNAs的过表达载体，通过PEG转化与农杆菌介导法转入龙眼原生质体与胚性愈伤组织。研究内容主要如下：
1 龙眼体胚发生早期相关的lncRNAs 的鉴定与靶基因预测
采用Illumina HiSeq测序技术对龙眼的3个样本（EC、ICpEC与GE）进行高通量测序，鉴定新型lncRNAs为7643个，其中6005个检测到表达。通过样本间两两对比的差异表达lncRNAs发现，在龙眼早期SE过程中，GE阶段存在更多特异的lncRNAs，作用主要在ICpEC到GE阶段。lncRNAs的功能主要通过cis或trans方式作用于靶基因来实现，对lncRNAs差异显著的靶基因进行KEGG富集分析发现，在EC vs.GE与ICpEC vs.GE中“植物-病原菌互作”与“植物激素信号转导”途径最富集。
2 龙眼体胚发生早期lncRNAs及其靶基因的筛选与表达分析
为了确定龙眼早期SE显著差异lncRNAs的表达，挑选了20个在RNA-Seq中表达量差异显著lncRNAs以及5个与植物激素信号转导相关的lncRNAs进行qRT-PCR验证。除了LTCONS-00027337之外，其余24个lncRNAs均可以在EC、ICpEC与GE中检测到表达。结果显示，24个lncRNAs中有16个lncRNAs的RNA-Seq与qRT-PCR的表达趋势一致。为进一步了解“植物激素信号转导”途径在龙眼体胚发生早期的作用，鉴定了其中6个关键的lncRNAs。在qRT-PCR中，6个lncRNA对其靶基因均为正调控关系，并且为顺式调节的。推测与植物激素信号转导相关的lncRNA主要在早期龙眼SE中起顺式调控的作用。
对lncRNAs靶基因ERF家族进行系统地鉴定，并对5个在龙眼早期SE过程中富集的ERF基因进一步分析发现。结果进一步表明，随着龙眼早期SE进行内源激素等方面发生显著变化，为了促进胚胎的正常发育，需要更多的DlERF基因参与。通过对5个在龙眼早期SE差异显著表达的DlERF基因进行qRT-PCR与RNA-Seq表达结果对比发现，大部分在龙眼早期SE 3个阶段的表达趋势一致，且其中3个DlERF基因在龙眼GE阶段表达量最高。由此可见，从EC到GE阶段需要更多的ERF基因来参与GE阶段的维持，也进一步说明在早期SE过程中，细胞分裂分化和抗性等方面也逐渐增强。使用不同浓度的外源激素处理龙眼胚性愈伤组织，从复杂的关系网络中可以看出，作为植物激素相关的lncRNAs，在龙眼SE过程中发挥着至关重要的作用。
3 龙眼体胚发生早期lncRNAs与miRNAs调控关系
除了与编码蛋白相互作用外，lncRNAs也可能与miRNA相互作用。本试验预测了龙眼lncRNAs作为miRNA的前体、靶基因以及内源诱捕靶标（endogenous target mimic，eTM）。为了进一步验证在龙眼SE早期发育期间lncRNA、miRNA和mRNA之间的关系，对Dlo-miR172a、Dlo-miR159a.1和Dlo-miR398a的预测网络进行qRT-PCR验证。通过对Dlo-miR172a、Dlo-miR159a.1和Dlo-miR398a过表达和抑制表达的样品中表达量分析，我们发现了龙眼中早期SE期间Dlo-miR172a与其相关的lncRNA和mRNA具有与预测相同的表达趋势。然而， Dlo-miR398a、Dlo-miR159a.1与其相关的mRNA和lncRNA之间的调节关系复杂，需要进一步探索。
4 龙眼体胚发生早期lncRNAs的过表达载体构建及瞬时表达
本试验构建了LTCONS-00042843与LTCONS-00006334的过表达载体，利用农杆菌介导法与PEG转化法，实现了LTCONS-00042843与LTCONS-00006334在龙眼原生质体与愈伤组织中过表达。从qRT-PCR结果中看出，在原生质体中，LTCONS-00042843与LTCONS-00006334及其靶基因均表现为显著上升，也进一步验证了LTCONS-00042843与LTCONS-00006334对其靶基因为正调控关系。LTCONS-00042843作为miR172a的eTM，对其存在负调控作用。但对于转入龙眼愈伤时， LTCONS-00042843与LTCONS-00006334的靶基因均表现出相反的趋势，与在体胚中的调控以及转入龙眼原生质体中的趋势存在差异，推测是由于试验的材料不同导致其调控网络或调控偏好性存在差异。
1 龙眼体胚发生早期相关的lncRNAs 的鉴定与靶基因预测
采用Illumina HiSeq测序技术对龙眼的3个样本（EC、ICpEC与GE）进行高通量测序，鉴定新型lncRNAs为7643个，其中6005个检测到表达。通过样本间两两对比的差异表达lncRNAs发现，在龙眼早期SE过程中，GE阶段存在更多特异的lncRNAs，作用主要在ICpEC到GE阶段。lncRNAs的功能主要通过cis或trans方式作用于靶基因来实现，对lncRNAs差异显著的靶基因进行KEGG富集分析发现，在EC vs.GE与ICpEC vs.GE中“植物-病原菌互作”与“植物激素信号转导”途径最富集。
2 龙眼体胚发生早期lncRNAs及其靶基因的筛选与表达分析
为了确定龙眼早期SE显著差异lncRNAs的表达，挑选了20个在RNA-Seq中表达量差异显著lncRNAs以及5个与植物激素信号转导相关的lncRNAs进行qRT-PCR验证。除了LTCONS-00027337之外，其余24个lncRNAs均可以在EC、ICpEC与GE中检测到表达。结果显示，24个lncRNAs中有16个lncRNAs的RNA-Seq与qRT-PCR的表达趋势一致。为进一步了解“植物激素信号转导”途径在龙眼体胚发生早期的作用，鉴定了其中6个关键的lncRNAs。在qRT-PCR中，6个lncRNA对其靶基因均为正调控关系，并且为顺式调节的。推测与植物激素信号转导相关的lncRNA主要在早期龙眼SE中起顺式调控的作用。
对lncRNAs靶基因ERF家族进行系统地鉴定，并对5个在龙眼早期SE过程中富集的ERF基因进一步分析发现。结果进一步表明，随着龙眼早期SE进行内源激素等方面发生显著变化，为了促进胚胎的正常发育，需要更多的DlERF基因参与。通过对5个在龙眼早期SE差异显著表达的DlERF基因进行qRT-PCR与RNA-Seq表达结果对比发现，大部分在龙眼早期SE 3个阶段的表达趋势一致，且其中3个DlERF基因在龙眼GE阶段表达量最高。由此可见，从EC到GE阶段需要更多的ERF基因来参与GE阶段的维持，也进一步说明在早期SE过程中，细胞分裂分化和抗性等方面也逐渐增强。使用不同浓度的外源激素处理龙眼胚性愈伤组织，从复杂的关系网络中可以看出，作为植物激素相关的lncRNAs，在龙眼SE过程中发挥着至关重要的作用。
3 龙眼体胚发生早期lncRNAs与miRNAs调控关系
除了与编码蛋白相互作用外，lncRNAs也可能与miRNA相互作用。本试验预测了龙眼lncRNAs作为miRNA的前体、靶基因以及内源诱捕靶标（endogenous target mimic，eTM）。为了进一步验证在龙眼SE早期发育期间lncRNA、miRNA和mRNA之间的关系，对Dlo-miR172a、Dlo-miR159a.1和Dlo-miR398a的预测网络进行qRT-PCR验证。通过对Dlo-miR172a、Dlo-miR159a.1和Dlo-miR398a过表达和抑制表达的样品中表达量分析，我们发现了龙眼中早期SE期间Dlo-miR172a与其相关的lncRNA和mRNA具有与预测相同的表达趋势。然而， Dlo-miR398a、Dlo-miR159a.1与其相关的mRNA和lncRNA之间的调节关系复杂，需要进一步探索。
4 龙眼体胚发生早期lncRNAs的过表达载体构建及瞬时表达
本试验构建了LTCONS-00042843与LTCONS-00006334的过表达载体，利用农杆菌介导法与PEG转化法，实现了LTCONS-00042843与LTCONS-00006334在龙眼原生质体与愈伤组织中过表达。从qRT-PCR结果中看出，在原生质体中，LTCONS-00042843与LTCONS-00006334及其靶基因均表现为显著上升，也进一步验证了LTCONS-00042843与LTCONS-00006334对其靶基因为正调控关系。LTCONS-00042843作为miR172a的eTM，对其存在负调控作用。但对于转入龙眼愈伤时， LTCONS-00042843与LTCONS-00006334的靶基因均表现出相反的趋势，与在体胚中的调控以及转入龙眼原生质体中的趋势存在差异，推测是由于试验的材料不同导致其调控网络或调控偏好性存在差异。