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棘球蚴病(Echinococcosis)又称包虫病(Hydatidosis),是一种可引起严重疾病负担并影响全球公共卫生安全和畜牧业发展的慢性人兽共患寄生虫病[1],可造成严重的医疗、社会和经济负担及后果[2-5]。所以早期、准确的诊断和检测,实时监测各类宿主的感染情况,对该病的防控具有重要意义[1,6]。本研究针对棘球绦虫的鉴别与棘球蚴病诊断方法的可操作性、检测灵敏度以及特异性,并依据重组酶介导的等温扩增方法(Recombinase-aided isothermal amplification,RAA)的原理,建立了检测细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的核酸等温扩增技术,具体开展以下三部分研究工作,以期为棘球绦虫的检测以及棘球蚴病的诊断提供可选择的检测方法:一、重组酶介导的等温核酸扩增技术检测细粒棘球绦虫G1方法的建立与初步应用评价本部分以细粒棘球绦虫G1(EgG1)线粒体基因序列(GenBankTM No.AF297617)作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成6对引物。经筛选获取最佳引物,并从温度、引物及醋酸镁3个方面以优比RAA反应体系。以PCR作为平行对照,分别以不同稀释浓度的基因组DNA及梯度稀释的含目的基因片段不同拷贝数的pMD19-T(Simple)克隆质粒进行RAA灵敏度扩增检测,同时以多房棘球绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、贾第鞭毛虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA为模板进行RAA扩增用于特异性评价。此外,分别对不同样本(感染EgG1的动物组织样本(10份)、模拟现场阳性犬粪样本(3份)以及现场阳性犬粪样本(5份))进行检测,以验证所建立的RAA检测方法的可靠性和实用性。本研究建立的RAA法可在40 min内特异性扩增EgG1的目的基因片段。经优化确立最佳温度为37℃,最佳引物(10μmol/L)用量为2μL,即反应浓度为0.4μmol/L,最佳醋酸镁(280mmol/L)用量为2.5μL,即反应浓度为14 mmol/L的反应体系。灵敏度方面,RAA法最低可检测到10 pg基因组DNA以及104个拷贝数的质粒;特异性方面,以其他寄生虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。感染EgG1样本检测结果均为阳性,且与PCR检测结果一致。二、重组酶介导的等温核酸扩增技术检测多房棘球绦虫方法的建立及初步应用评价本部分以多房棘球绦虫(Em)线粒体基因序列(GenBankTM No.AB01 8440)作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成5对引物。经筛选获取最佳引物后,再从温度、引物及醋酸镁3个方面以优化RAA反应体系。以PCR作为平行对照,分别以不同稀释浓度的基因组DNA及梯度稀释的质粒进行RAA扩增,以评价RAA检测方法的灵敏度;同时以其他寄生虫基因组DNA为模板进行RAA扩增用于特异性评价。此外,分别对不同样本(感染Em的动物组织样本(9份)、模拟现场阳性犬粪样本(3份)以及现场阳性犬粪样本(2份))进行检测,以验证所建立的RAA检测技术的可靠性和实用性。本研究建立的RAA法可在40 min内特异性扩增Em的目的基因片段。经优化确立最佳温度为37℃,最佳引物(10μmol/L)用量为2μL,即反应浓度为0.4μmol/L,最佳醋酸镁(280mmol/L)用量为2.5μL,即反应浓度为14 mmol/L的反应体系。灵敏度方面,RAA法最低可检测到10 pg基因组DNA以及104个拷贝数的质粒;特异性方面,以其他寄生虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。感染的样本检测结果均为阳性,且与PCR检测结果一致。三、重组酶介导的多重核酸等温扩增法鉴别细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫技术的建立与初步应用评价本部分利用第一与第二部分所设计的引物(专利申请号:20191116433 7.5)建立了可在40 min内特异性扩增EgG1与Em目的基因片段的重组酶介导的多重核酸等温扩增方法(Multiplex recombinase-aided isothermal amplification,mRAA)。实验分别从温度、引物及醋酸镁3个方面进行多重RAA反应体系的优化。以mPCR作为平行对照,应用mRAA方法扩增不同稀释浓度的基因组DNA及梯度稀释的质粒,以评价RAA检测方法的灵敏度;同时检测多种寄生虫的基因组DNA,以评价其特异性。对所建立的方法优化后,应用于样本(感染棘球绦虫的动物组织样本19份(Eg,10份;Em,9份)、模拟现场阳性犬粪样本3份(含Eg与Em混合样本,3份)以及现场阳性犬粪样本7份(Eg,5份;Em,2份))的检测,以验证所建立的mRAA检测技术的可靠性和实用性。本研究经优化确立了最佳温度为37℃,EgG1正、反向引物(10μmol/L)最佳用量各为1μL,即反应浓度为0.2μmol/L,Em正、反向引物(10μmol/L)各为1.5μL,即反应浓度为0.3 μmol/L,醋酸镁(280mmol/L)最佳用量为2.5 μL,即反应浓度为14 mmol/L的反应体系。在灵敏度检测方面,mRAA最低可检测出0.1 ng的基因组DNA以及104个拷贝数的质粒;在特异性检测方面,以其他寄生虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。感染样本mRAA检测结果均为阳性,且与mPCR检测结果一致。本研究建立的RAA以及mRAA检测方法较常规PCR快速,检测灵敏度和特异性均较高,其在EgG1与Em虫种的鉴定方面以及棘球蚴病基因诊断方面具有重要价值,为快速检测提供一种新的敏感和特异的工具。有望为棘球蚴病的现场防治工作提供高效、快速的技术支撑。