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蛋白质水解形成的具有生物活性的肽类被证实是涉及人体内多种细胞功能的重要物质,生物活性肽的各种功能活性及作用机理的研究是开发蛋白肽保健功能食品和药品的重要理论基础。本文以Alcalase 2.4L碱性蛋白酶水解得到的绿豆肽(MBPs)为研究对象,通过氨基酸自动分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、傅里叶变换红外光谱、高效液相色谱和质谱等方法,分析其氨基酸组成、分子量分布和结构特点,进而研究其对巨噬细胞内糖原、核酸、酸性ATP酶(ATPase)、溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响,并通过测定巨噬细胞NO的分泌量、iNOS活性以及iNOSmRNA表达量等指标讨论其对巨噬细胞免疫活性的影响。研究内容和结果如下:1.MBPs的结构鉴定和分析。水解度为32.25%的MBPs共包含17种氨基酸,包括非极性氨基酸28.37%、极性中性氨基酸15.03%、酸性氨基酸32.27%和碱性氨基酸24.33%,免疫相关的非极性和碱性氨基酸含量较高;SDS-PAGE和HPLC显示其分子量在6.5KDa以下的含量丰富。红外结果显示,MBPs可能含多种不饱和基团,仍含有蛋白质二级结构中的α-螺旋和β-折叠,而不规则卷曲和β-转角结构已被酶解而打开;质谱得到MBPs包含216种肽段主要归属于匹配度较高的24种蛋白质来源,肽末端非极性和碱性氨基酸含量较高。2.MBPs对巨噬细胞中活性物质的影响。MBPs对巨噬细胞增殖的MTT法检测结果显示,MBPs能够显著促进巨噬细胞的增殖(P<0.05),并能减弱LPS对巨噬细胞增殖的抑制作用;MBPs培养的巨噬细胞糖原和核酸染色明显加深,一定程度上反应了MBPs培养后巨噬细胞活跃度增强;MBPs浓度为200μg/mL以上时对巨噬细胞内ATPase活性有显著的促进作用(P<0.05),MBPs可以显著缓解LPS对ATPase活性的抑制;MBPs浓度大于100μg/mL时,对巨噬细胞内LZM活性增强作用显著(P<0.05),对LPS导致的LZM活性减弱有显著(P<0.05)的缓解作用。MBPs浓度在200μg/mL以上才对巨噬细胞酶内SOD活性和抑制LPS的刺激作用有显著的效果(P<0.05)。3.MBPs对巨噬细胞NO、iNOS及iNOS mRNA的影响。MBPs对巨噬细胞的培养时间在24h之后显著(P<0.05)增强其NO分泌量。MBPs对巨噬细胞NO分泌有促进作用,添加量为10μg/mL时对巨噬细胞NO分泌量影响不显著(P>0.05),浓度为200μg/mL和400μg/mL两组之间比较没有统计学上的差异,MBPs对巨噬细胞分泌NO的促进效果较LPS低,并可以显著降低LPS对巨噬细胞的刺激。MBPs和LPS都能够显著(P<0.05)提高iNOS的活性,但MBPs又能够抑制LPS导致的iNOS过度表达,且MBPs浓度越高作用效果越明显。iNOSmRNA实时荧光定量PCR分析结果显示,MBPs培养的巨噬细胞中iNOSmRNA表达量有所增加,但低于LPS单独刺激的作用效果,MBPs也可以减轻LPS引起的巨噬细胞iNOSmRNA的过度表达。MBPs分子量大多集中在6.5KDa以下,结构存在α-螺旋和不规则卷曲,包含肽段丰富。MBPs能够促进巨噬细胞的增殖提高巨噬细胞活性,对巨噬细胞NO分泌、i NOS活性和iNOSmRNA表达的也有促进作用,说明能促使巨噬细胞发挥免疫作用。