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肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上常见的恶性肿瘤之一,目前在肝癌的治疗中还存在早期诊断困难，根治性切除机会小,复发转移率高，对放化疗不敏感,总体疗效欠佳的现状。去甲斑蝥素（norcantharidin NCTD）是斑蝥素的化学结构中去除1，2位甲基人工合成而得的衍生物。临床上主要用于食管癌、胆管癌及乳腺癌等的治疗，尤其在肝癌中的治疗效果较好。有实验研究认为NCTD可以通过诱导肝癌细胞的凋亡起到抗肿瘤的作用，但其引起凋亡的具体机制尤其是哪些信号转导通路参与其中尚有待进一步阐明。其中c-Jun氨基末端激酶(c-JunNH2-teminal Kinase, JNK)信号转导通路与核转录因子-kappa B(nuclearfactor-κB, NF-κB)信号转导通路在调控细胞凋亡的机制中研究较多。我们通过体外细胞实验研究，探讨NCTD对肝癌细胞增殖和凋亡影响及JNK与NF-κB信号转导通路在其中发挥的作用。目的：本实验主要通过不同浓度的NCTD干预体外培养的人肝肝癌细胞SMMC-7721，研究其对活化的肝癌细胞增殖及凋亡的影响；以及JNK与NF-κB信号转导通路在其中可能的作用机制。方法：应用MTT法检测NCTD对活化的肝癌细胞增殖的影响；Hoechst33342染色荧光显微镜下观察细胞凋亡形态学变化；流式检测细胞凋亡率；以Western blot法检测JNK、p-JNK、NF-κBp65及IκBα蛋白表达。结果：1去甲斑蝥素对SMMC-7721增殖的影响MTT法检测细胞增殖显示，对照组与不含DMSO组A492值无差别（p>0.05），说明0.05%DMSO对SMMC-7721增殖没有影响；不同浓度的去甲斑蝥素(5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml,80μg/ml)分别作用12h、24h、36h、48h与各时间对照组相比A492值明显降低，对照组的A492值总体均数与不同浓度的去甲斑蝥素组的差异有统计学意义(p<0.05)；不同时间与浓度的去甲斑蝥素的作用对肝癌细胞的抑制率具有一定的时间和剂量依赖性。48h时抑制最强且IC50约为40μg/ml。2去甲斑蝥素对SMMC-7721凋亡的影响2.1Hoechest33342染色荧光显微镜下检测细胞凋亡形态显示：对照组细胞大小均匀，NCTD干预SMMC-7721后，细胞核浓缩、凋亡小体出现，说明NCTD可诱导活化的肝癌细胞凋亡，除无DMSO组与对照组间凋亡率无统计学差异（p>0.05）；其他各组在加入40μg/mlNCTD作用不同时间(12h,24h,36h,48h)后细胞凋亡率与对照组相比有统计学差异（p<0.05）。说明DMSO对肝星状细胞凋亡无明显影响,去甲斑蝥素对肝癌细胞有促进凋亡的作用，且与药物作用时间有关，作用时间越长凋亡率越高，12h开始增高（11.2%±0.20%），48h明显增多（34.13%±1.00%）。2.2流式细胞仪检测细胞凋亡率结果示：DMSO组与对照组间凋亡率无统计学差异（p>0.05），其他各组作用48h后细胞凋亡率与对照组相比有统计学差异（p>0.05）。去甲斑蝥素对肝癌细胞有促进凋亡的作用，且与药物浓度有关，浓度越高作用越强。在加入NCTD前1h预先加入JNK特异性阻断剂SP600125后，细胞凋亡率（19.60%±0.70%）较40μg/ml NCTD组（25.63%±1.12%）有所下降（p<0.05）。表明SP600125可一定程度抑制去甲斑蝥素的促凋亡作用。3去甲斑蝥素及SP600125对SMMC-7721细胞中JNK与NF-κB信号通路的影响3.1DMSO对细胞各通路影响结果分析：Western blot结果显示，无DMSO组与对照组间各蛋白表达灰度值无明显差异（p>0.05），说明DMSO对SMMC-7721细胞的JNK与NF-κB两条信号转导通路无明显影响。3.2NCTD及SP600125对JNK信号通路影响：对JNK信号通路蛋白灰度值分析显示，除DMSO组外，其他各组与对照组间p-JNK的表达有统计学差异（p<0.05），且随药物浓度升高p-JNK的表达逐渐增强，当在药物组预先加入SP600125后，p-JNK的表达较40μg/ml NCTD组明显下降。而JNK的表达在各组间无明显变化。说明，NCTD在对SMMC-7721的作用中使JNK的活化增加，而SP600125可有效抑制NCTD对其的活化。3.3NCTD及SP600125对NF-κB信号通路影响：对NF-κB信号通路蛋白灰度值分析显示，除DMSO组外，其他各组与对照组间核蛋白NF-κBp65及胞浆IκBα蛋白的表达有统计学差异（p<0.05），且随药物浓度升高NF-κBp65及IκBα的表达都逐渐降低，当药物组预先加入SP600125后，NF-κBp65及IκBα的表达较40μg/ml NCTD组有所增加，差异有统计学意义（p<0.05）。NCTD在对SMMC-7721的作用中使NF-κB的活化降低，而SP600125在有效抑制JNK活化的同时，对NF-κB也起到了一定促进活化的作用。结论：1体外细胞培养研究结果表明，去甲斑蝥素可抑制活化SMMC-7721细胞的增殖，其抑制作用具有一定时间-剂量效应。2去甲斑蝥素可诱导SMMC-7721细胞凋亡,且其在促进细胞凋亡中具有一定的时间与剂量依赖性。3去甲斑蝥素通过促进JNK信号转导通路的活化与抑制NF-κB活性促进SMMC-7721细胞的凋亡；且JNK通路对NF-κB有一定抑制效应，二者相互作用，共同调控着细胞的凋亡。