论文部分内容阅读
2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2G）是L-抗坏血酸的糖基化衍生物,它既能保持性质稳定,同时能通过α-葡萄糖苷酶作用产生L-抗坏血酸,从而能够发挥L-抗坏血酸的生理功能,是L-抗坏血酸的绝佳替代品,因此在化妆品、医药、食品和饲料添加剂等领域具有广泛应用。环糊精葡萄糖基转移酶（简称CGTase,EC 2.4.1.19）是用于催化合成AA-2G的酶中应用最广、研究最多的一种酶,但目前CGTase制备AA-2G存在转化率低、酶产量低等问题,导致AA-2G的生产成本高,限制其广泛应用。针对以上问题,本论文主要以Bacillus stearothermophilus NO2（Bs）CGTase为研究对象,通过序列比对分析及定点突变探究CGTase受体位点的芳香族氨基酸对CGTase制备AA-2G的影响,并对CGTase底物结合的受体位点非芳香族氨基酸和供体位点氨基酸进行分子改造,同时利用异淀粉酶和CGTase协同作用制备AA-2G。最后通过分子改造提高CGTase在大肠杆菌中的可溶性表达。主要研究结果如下:（1）CGTase受体位点芳香族氨基酸对受体特异性的影响。CGTase制备AA-2G的反应中存在葡萄糖和麦芽糖等副产物,可以作为受体与L-抗坏血酸竞争,导致AA-2G的转化率低。为探究受体位点芳香族氨基酸对受体底物特异性以及AA-2G转化率的影响,对CGTases进行序列比对分析,发现AA-2G转化率高的CGTase受体亚位点的191和255位点（按Bs CGTase氨基酸编号计）氨基酸均为苯丙氨酸（F）,而转化率最低的CGTase受体位点191和255位点均为酪氨酸（Y）,设计并获得Bs CGTase、Bacillus circulans 251（Bc）CGTase和Paenibacillus macerans（Pm）CGTase的五个突变体Bs F191Y、Bs F255Y、Bc Y195F、Pm Y195F和Pm Y260F进行验证。在最优条件下突变体Bs F191Y和Bs F255Y AA-2G的产量分别比Bs CGTase低34.3%和7.9%,突变体Bc Y195F AA-2G的产量比Bc CGTase高45.8%,突变体Pm Y195F和Pm Y260F AA-2G的产量分别比Pm CGTase高36.9%和12.6%。实验结果表明191和255位点氨基酸为F时,AA-2G的转化率高;而为Y时,AA-2G的转化率低。动力学研究表明,三个CGTases的191位点为F时,降低葡萄糖和麦芽糖的特异性,提高L-抗坏血酸特异性;Bs CGTase和Pm CGTase的255位点为F时,降低葡萄糖的特异性,提高L-抗坏血酸特异性。（2）CGTase受体位点非芳香族氨基酸突变提高L-抗坏血酸特异性。采用位于酸碱催化剂Glu 253 10?以内、位于受体底物结合位点、氨基酸的保守性≤30%三个原则选择8个非芳香族氨基酸构建Bs CGTase饱和突变库。筛选获得突变体Bs K228R、Bs M230L和Bs K228R/M230L,通过反应条件优化,确定制备AA-2G的最适温度为30°C、最适pH为5.0和最适加酶量为2000 U·g-1麦芽糊精。为提高生产强度,以250 g·L-1 L-抗坏血酸为底物,优化麦芽糊精浓度,当500 g·L-1麦芽糊精为糖基供体时AA-2G的产量达到210.3 g·L-1,比野生型提高48.9 g·L-1。动力学分析表明突变体Bs K228R、Bs M230L和Bs K228R/M230L的L-抗坏血酸Km值分别比野生型CGTase低20.3%、30.4%和34.8%,而kcat/Km分别是野生型的2.08、2.06和2.69倍。同时双突变体Bs K228R/M230L以葡萄糖作为受体的kcat/Km是野生型的1.67倍,以麦芽糖作为受体的kcat/Km是野生型的0.28倍,因此Bs K228R/M230L对L-抗坏血酸作为受体的特异性提高。（3）CGTase供体位点突变提高麦芽糊精特异性。选取-3亚位点和-6亚位点8个氨基酸构建Bs CGTase饱和突变库,筛选获得突变体Bs S90D、Bs G176H和Bs S90D/G176H,以500 g·L-1麦芽糊精和250 g·L-1 L-抗坏血酸为底物,Bs S90D/G176H的AA-2G产量达到185.0 g·L-1,比野生型提高23.6 g·L-1。动力学分析表明突变体S90D的麦芽糊精Km值比野生型CGTase高12.5%,Bs G176H和Bs S90D/G176H的麦芽糊精Km值分别比野生型CGTase低13.5%和8.7%,而Bs S90D、Bs G176H和Bs S90D/G176H的kcat/Km分别是野生型的1.17、1.30和1.47倍。将Bs S90D、Bs G176H分别与Bs K228R/M230L进行组合,获得AA-2G转化率最高的组合突变体Bs S90D/K228R/M230L,AA-2G产量为216.8 g·L-1,比双突变体Bs K228R/M230L的AA-2G产量高6.5 g·L-1,比野生型高55.4g·L-1。将异淀粉酶与突变体Bs S90D/K228R/M230L复配制备AA-2G,麦芽糊精浓度降低为350 g·L-1,AA-2G的产量能达到208.4 g·L-1,降低麦芽糊精成本,并且降低溶液的粘度与副产物浓度,有利于后期的分离纯化。（4）分子改造提高CGTase在大肠杆菌中的可溶性表达。采用易错PCR构建突变文库,筛选获得Bs CGTase三株酶活提高突变体,利用定点突变识别影响酶活的突变位点,发现Bs I631T、Bs I641T和Bs K647E的酶活分别是野生型(141 U·mL-1)的1.7、2.1和2.2倍,突变体Bs I631T/I641T、Bs I631T/K647E、Bs I641T/K647E和Bs I631T/I641T/K647E的酶活分别是野生型的1.9、1.8、1.3和1.2倍,未有叠加效果。通过CGTase多重序列比对分析发现K647在CGTase家族中较保守,选取Bc CGTase、Pm CGTase和Anaerobranca gottschalkii（Ag）CGTase引入相应位点的突变,获得三个突变体Bc K654E、Pm K655E和Ag K656E,酶活分别为62、39和113 U·mL-1,是其野生型的2.0、1.5和1.0倍。通过结构模拟分析四个CGTases及其突变体的表面负电荷,发现在具有低表面负电荷CGTase引入负电荷增加的突变可能会增加CGTase的可溶性表达。将Bs CGTase和酶活最高突变体Bs K647E在3 L发酵罐中发酵,Bs K647E的酶活为2150.6 U·m L-1,是野生型(960.3 U·mL-1)的2.2倍。将Bs K647E与Bs K228R/M230L和Bs S90D/K228R/M230L分别组合进行3 L发酵罐发酵,组合突变体Bs K228R/M230L/K647E和Bs S90D/K228R/M230L/K647E的最高酶活分别为2025.2和1344.5 U·m L-1,是野生型的2.1和1.4倍。同时将Bs K228R/M230L/K647E和Bs S90D/K228R/M230L/K647E进行AA-2G制备,发现组合突变体分别与Bs K228R/M230L、Bs S90D/K228R/M230L的AA-2G产量一致,酶活提高的突变体对AA-2G的转化率无影响。