研究目的随着骨组织工程研究深入以及向临床过渡的逐渐展开，一个主要的问题就是如何构建大块组织工程骨在体内存活并发挥功能作用，充分的血液供应是最初和最基本的环节，有决定性影响。如不能建立有效的血循环，组织工程骨只能被限制在修复小、薄的骨缺损。而神经系统对于骨组织的生长、发育、创伤修复都具有重要的作用。在动物(新西兰大白兔)体内制造股骨大段骨缺损模型，利用组织工程学方法，采用显微外科技术，分别构建神经化、血管化的组织工程骨在体内修复大段骨缺损。通过对血管化、神经化的组织工程骨修复骨缺损的效果进行大体和组织学的观察与比较，探讨神经化、血管化在组织工程化骨构建中的作用，为其在临床的应用提供依据。1、研究在大段组织工程骨内分别植入感觉神经束、运动神经束、感觉与运动神经束对大段组织工程骨早期成骨的影响，并利用免疫组化染色来初步探讨促进成骨的机制。2、比较感觉神经束植入与血管束植入对大段组织工程骨早期成骨的影响，并利用免疫组化染色来初步探测其促进成骨的机制。实验方法1、神经束植入对大段组织工程骨成骨影响的实验研究1、1将6月龄成年新西兰大白兔48只，分别通过穿刺从髂前上嵴抽取骨髓，提取骨髓基质干细胞进行扩增、诱导分化为成骨细胞，与带侧槽的β—磷酸三钙复合制作组织工程骨；分别将不同类型神经束植入组织工程骨的侧槽中，进行以下分组：A组，组织工程骨组；B组，运动神经束植入组(股神经肌支)；C组，感觉神经束植入组(隐神经)；D组，感觉、运动神经束联合植入组(隐神经+股神经肌支)。制造兔股骨1.5cm大段骨缺损，采用四孔钢板固定，在缺损处植入构建好的组织工程骨，再植入相应的神经。1、2各组分别在术后4、8、12w取材，进行大体标本观察。再对骨缺损区组织以40g／L的多聚甲醛固定，150g／L的乙二胺四乙酸脱钙后石蜡包埋，行HE及Masson染色，采用图像分析方法分析新生骨小梁面积象素值，并计算其占视野总面积象素值的百分数。按4×3析因设计方差分析将数据作统计学处理，若有显著差异再以LSD法行多重比较，用以比较骨缺损区的修复情况。1、3对各组标本行降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide，CGRP)及S-100的免疫组化染色。图像分析测定阳性染色的灰度值，再计算出每张切片的平均灰度值(平均灰度值与免疫表达强度呈反比)。分别按4×3析因设计方差分析将数据作统计学处理，若有显著差异再以LSD法行多重比较，初步探讨促进成骨的机制。2、血管神经化对大段组织工程骨成骨影响的比较研究2、1将6月龄成年新西兰大白兔36只，制作组织工程骨的方法同第一部分；将血管束、感觉神经束分别植入组织工程骨的侧槽中，进行以下分组：A组，组织工程骨组；B组，血管束植入组(含有自主神经)；C组，感觉神经束植入组(隐神经)。制造兔股骨1.5cm大段骨缺损，采用四孔钢板固定，在缺损处植入构建好的组织工程骨，再植入相应的血管神经束。2、2各组分别在术后4、8、12w取材，进行大体标本观察，再对骨缺损区组织以40g／L的多聚甲醛固定，150g／L的乙二胺四乙酸脱钙后石蜡包埋，行HE及Masson染色，采用图像分析方法分析新生骨小梁面积象素值，并计算其占视野总面积象素值的百分数。按3×3析因设计方差分析将数据作统计学处理，若有显著差异再以LSD法行多重比较，用以比较骨缺损区的修复情况。2、3对各组标本行降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide，CGRP)及神经肽Y(Neuropeptide Y，NPY)的免疫组化染色。图像分析测定阳性染色的灰度值，再计算出每张切片的平均灰度值(平均灰度值与免疫表达强度呈反比)。按3×3析因设计方差分析将数据作统计学处理，若有显著差异再以LSD法行多重比较，初步探讨其促进成骨的机制。结果1、神经植入对大段组织工程骨成骨影响的实验研究1、1大体观察：术后各时间点、各组都有不同程度的新生骨痂形成，以C组与D组的骨痂量多于A组与B组。1、2组织学观察及统计学分析：随着时间的延长，各组的新生骨组织都有不同程度的增多，差异有统计学意义(F=456.427，P＜0.000)。各组间的新生骨组织量有显著性差异(F=112.359，P＜0.000)，从各时间点看，每一时间点各组的新生骨组织量均有显著性差异。时间点与神经植入之间存在的交互效应有统计学意义(F=3.111，P=0.015)。对每一时间点用LSD法行多重比较可见，在各时间点C组(感觉神经束植入组)与D组(感觉、运动神经束联合植入组)均多于A组(单纯组织工程骨组)与B组(运动神经束植入组)，C组与D组间差异无统计学意义，A组与B组间差异无统计学意义。1、3 CGRP、S—100的免疫组化染色及统计学分析：对植入物区新生骨组织内CGRP染色灰度值的统计学分析显示随着时间的延长，各组新生骨组织内CGRP的表达量都有不同程度的增多，差异有统计学意义(F=258.046，P＜0.000)。各组间的新生骨组织内CGRP的表达量有显著性差异(F=689.552，P＜0.000)。时间点与神经植入之间存在的交互效应有统计学意义(F=25.915，P=0.015)。多重比较显示各时间点C组(感觉神经束植入组)与D组(感觉、运动神经束联合植入组)均多于A组(单纯组织工程骨组)与B组(运动神经束植入组)，C组与D组间差异无统计学意义，A组与B组间差异无统计学意义。对植入物区新生骨组织内S-100染色灰度值的统计学分析显示随着时间的延长，各组新生骨组织内S-100的表达量都有不同程度的增多，差异有统计学意义(F=346.524，P＜0.000)；各组间的新生骨组织内S-100的表达量有显著性差异(F=713.807，P＜0.000)。时间点与神经植入之间存在的交互效应有统计学意义(F=2.906，P=0.020)。多重比较显示各时间点C组(感觉神经束植入组)与D组(感觉、运动神经束联合植入组)均多于A组(单纯组织工程骨组)与B组(运动神经束植入组)，C组与D组间无差异，A组与B组间无差异。2、血管神经化对大段组织工程骨成骨影响的比较研究2、1大体观察：术后各时间点、各组都有不同程度的新生骨形成，以B组与C组的骨痂量优于A组。2、2组织学观察及统计学分析：对植入物区新生骨组织评分结果的统计学分析显示随着时间的延长，新生骨组织都有不同程度的增多，差异有统计学意义(F=105.735，P＜0.000)。各组间的新生骨组织量有显著性差异(F=290.008，P＜0.000)。时间点与神经植入之间存在的交互效应有统计学意义(F=3.177，P=0.029)。对每一时间点用LSD法行多重比较可见，在4w时B组(血管束植入组)优于A组(单纯组织工程骨组)与C组(感觉神经束植入组)，C组多于A组；在8w和12w时，B组与C组均多于A组，B组与A组之间无差别。2、3 CGRP及NPY的免疫组化染色及统计学分析：对植入物区新生骨组织内CGRP灰度值的统计学分析显示随着时间的延长，新生骨组织内CGRP的表达都有不同程度的增多，差异有统计学意义(F=95.392，P＜0.000)。各组间的新生骨组织内CGRP的表达量有显著性差异(F=415.324，P＜0.000)。时间点与神经植入之间存在的交互效应有统计学意义(F=16.475，P＜0.000)。对每一时间点各组间用LSD法行多重比较可见，在4w时B组(血管束植入组)多于A组(单纯组织工程骨组)与C组(感觉神经束植入组)，而C组多于A组，而在8w和12w时，B组与C组均多于A组，B组与A组之间无差别。对植入物区新生骨组织内NPY灰度值的统计学分析显示随着时间的延长，新生骨组织内NPY的表达都有不同程度的增多，差异有统计学意义(F=892.240，P＜0.000)。各组间的新生骨组织内NPY的表达量有显著性差异(F=118.373，P＜0.000)。时间点与神经植入之间存在的交互效应有统计学意义(F=30.509，P＜0.000)。多重比较显示在4w时B组(血管束植入组)多于A组(单纯组织工程骨组)与C组(感觉神经束植入组)，而C组多于A组；在8w和12w时，B组与C组均多于A组，B组与A组之间无差别。结论1、在组织工程骨内植入感觉神经或感觉神经联合运动神经在早期可促进成骨，而单纯植入运动神经未见明显促进作用。2、感觉神经植入或感觉神经联合运动神经植入大段组织工程骨内可促进CGRP、S-100在新生骨组织内的表达，而植入运动神经却无此作用。3、大段组织工程骨内植入血管束在4w时的促组织工程骨的生长作用要优于感觉神经植入，但在8w与12w时与感觉神经植入无显著差异。4、血管束植入大段组织工程骨内可促进NPY、CGRP在新生骨组织内的表达。5、在组织工程骨内植入血管束可早期增加细胞材料复合物的改建界面，加快改建速度，提高大段组织工程骨的成骨速度和质量。