本文是国家科技支撑计划课题(编号:2012BAD33B03)“食源性功能肽生物制备技术研究”的部分内容,主要研究食源性生物活性肽的代谢组学作用机制。大豆是中国重要粮食作物之一,含有丰富植物蛋白质,营养价值很高。大豆多肽是用蛋白酶将大豆蛋白质水解,再经分离、纯化等操作而得到的一种氨基酸链或蛋白质片段,其氨基酸组成平衡,含量丰富,还具有大豆蛋白质所不具备的良好的溶解性、吸水性等理化性质,而且具有易吸收性、降低胆固醇、降低血压等多种生理功能。TTYY是从大豆蛋白质中提取的一种具有较强抗氧化能力的生物活性肽,将其应用于食品中可提高食品的营养价值,因此,有必要对它的作用机制进行探讨,以确定其保健功效。代谢组学是系统生物学的一个分支,它研究的是作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物,通过对这些小分子代谢物的深入研究,有可能找出相关的生物标志物,分析生物标志物所涉及的代谢途径,进而判断机体所处的生理状态,并解析机体对外源性或内源性刺激进行应答的反馈信息,具有整体性、系统性和动态性的特点。将代谢组学的方法应用于食品领域中,可以全面考察某种食品或营养物质对机体代谢的影响,判断变化发生的层面,从分子水平上认识其作用机制。本文以大鼠作为研究对象,以TTYY作为外源性刺激,分析大鼠机体抗氧化能力的变化,并利用代谢组学方法研究大鼠在刺激作用下的机体的代谢响应,从整体上研究代谢物组和代谢通路的变化,从而解析TTYY的作用机制。主要研究内容如下:(1)TTYY的抗氧化功能评价采用注射D-半乳糖的方法建立大鼠的氧化损伤模型,并对氧化损伤大鼠进行灌胃TTYY处理,测其血清、肝脏和肾脏提取液,指标主要分为四方面:(1)脂质氧化产物:丙二醛(MDA);(2)蛋白质氧化产物:羰基;(3)抗氧化酶活性:超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和总抗氧化力(T-AOC);(4)抗氧化物质:谷胱甘肽(GSH)。结果显示,TTYY处理使MDA和羰基含量下降,抗氧化酶活性和GSH含量升高,且处理剂量不同改变的效果不同,0.4mg TTYY/g体重的处理剂量效果最佳,说明TTYY减轻了脂质和蛋白质的氧化损伤,提高了抗氧化酶活性和抗氧化物质含量,增强了大鼠机体的抗氧化能力。根据抗氧化功能评价结果判断原则规定,上述四项指标中有三项为阳性,即可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果为阳性。本实验中四项指标均为阳性,据此判定多肽TTYY具有抗氧化功能。(2)TTYY作用于大鼠的血清和尿液代谢组学研究应用代谢组学方法研究大鼠分别灌胃TTYY10天、20天和30天后血清和尿液代谢物组的变化,采用PCA和PLS-DA得分图方法分析剂量组与对照组之间的分类聚合情况,采用PLS-DA载荷图方法提取差异性代谢产物,结果发现处理10天代谢物基本没有变化,处理20天有少量代谢物有变化,处理30天有多种代谢物有变化,说明在本文所研究的时间范围内30天是最佳处理时间。从差异性代谢产物中提取生物标志物,血清中鉴定出10种:丙酮酸、亮氨酸、甘氨酸、胆碱、缬氨酸、3-羟基丁酸、丙氨酸、乙酸、谷氨酸和肌酸,尿液中鉴定出14种:丙酮酸、缬氨酸、柠檬酸、马尿酸、胆碱、琥珀酸、苯丙氨酸、乙酸、乳酸、3-羟基丁酸、肌酸、肌酸酐、丙氨酸和牛磺酸。(3)TTYY作用于大鼠的肝脏代谢组学研究应用代谢组学方法研究大鼠分别灌胃TTYY10天、20天和30天后肝脏代谢物组的变化,采用PCA和PLS-DA得分图方法分析剂量组与对照组之间的分类聚合情况,采用PLS-DA载荷图方法提取差异性代谢产物,结果发现处理10天或20天都只有少量代谢物有变化,处理30天有多种代谢物有变化,说明在本文所研究的时间范围内30天是最佳处理时间。从差异性代谢产物中提取生物标志物,共鉴定出8种:异亮氨酸、亮氨酸、肝糖原、胆碱、缬氨酸、乳酸、肌酸和牛磺酸。根据血清、尿液和肝脏中的生物标志物涉及的代谢途径研究机体代谢通路的变化,结果发现,TTYY处理改变了大鼠的能量代谢、脂质代谢和氨基酸代谢水平,各种代谢水平均向着增强中心能量代谢途径的趋势改变,证明TTYY对大鼠机体有积极的影响。(4)TTYY对氧化损伤大鼠的保护性作用的血清和尿液代谢组学研究采用注射D-半乳糖的方法建立大鼠的氧化损伤模型,鉴定出与氧化损伤有关的生物标志物,血清中有亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白,尿液中有乳酸、乙酸、磷酸乙醇胺、甲酸、丙氨酸、胆碱、甘氨酸、丙酮酸、2-酮戊二酸、柠檬酸、牛磺酸和苯乙酰甘氨酸。对氧化损伤大鼠灌胃不同剂量的TTYY,测定血清和尿液代谢物组的变化,鉴定与TTYY有关的生物标志物,结果发现这些生物标志物与氧化损伤有关的生物标志物的种类基本相同,变化趋势相反,说明TTYY可以缓解或恢复D-半乳糖造成的氧化损伤。(5)TTYY对氧化损伤大鼠的保护性作用的肝脏代谢组学研究采用注射D-半乳糖的方法建立大鼠的氧化损伤模型,鉴定出与氧化损伤有关的生物标志物,主要有异亮氨酸、亮氨酸、肝糖原、胆碱、缬氨酸、谷氨酰胺、乳酸、乙酸、酪氨酸、肌酸和牛磺酸。对氧化损伤大鼠灌胃不同剂量的TTYY,测定肝脏代谢物组的变化,鉴定与TTYY有关的生物标志物,结果发现这些生物标志物与氧化损伤有关的生物标志物的种类基本相同,变化趋势相反,说明TTYY可以缓解或恢复D-半乳糖造成的氧化损伤。对血清、尿液和肝脏中的生物标志物涉及的代谢途径进行分析,发现D-半乳糖处理后,大鼠的能量代谢、氨基酸代谢及脂质代谢均发生改变,代谢效率降低,但是经灌胃TTYY后,这种改变得以缓解和恢复,代谢强度也有所增加,PPM组最接近于对照组,即TTYY的最佳剂量是0.4mg TTYY/g体重。因此可以得出结论,TTYY对大鼠机体有保护性作用。