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LIM结构域蛋白家族含有两个锌指结构构成的LIM结构域并富含β折叠二级结构。近年来,越来越多的报道认为含有该结构域的蛋白质在多种肿瘤的发生及发展中发挥着非常重要的作用。本项工作的主要研究目的是通过对两种同源性较高的LIM家族蛋白及其LIM结构域进行体外的重组表达和对其纯化条件的优化,获得均一性好并可用于蛋白质晶体学研究的重组蛋白,并进行初步的晶体筛选,为后续的晶体结构学研究奠定基础。
我们利用大肠杆菌原核表达系统构建了MBP-LMO1与LIM(LHX2)-LID(LDB1)的表达克隆。重组的MBP-LMO1蛋白N端为麦芽糖结合蛋白,C端为LMO1蛋白,利用天然构象下麦芽糖结合蛋白的两个结构域之间的狭缝,使LMO1蛋白保持体外的稳定性。在实验中,使用该克隆表达的融合蛋白产量高,可溶性好,能够通过亲和层析、凝胶排阻色谱和离子交换色谱方法纯化,最终获得纯度高且稳定性好的MBP-LMO1融合蛋白。在进行初步的晶体筛选之后,我们成功获得了该重组蛋白的初晶。为进一步探讨LIM结构域的功能和结构,我们又选择了LHX家族中的LHX2蛋白作为靶蛋白进行研究。重组的LIM(LHX2)-LID(LDB1)蛋白N端为LHX2蛋白的LIM结构域,C端为LDB1的LID结构域,利用天然构象的LID结构域和LIM结构域的互补相互作用使得LHX2蛋白在体外的稳定性大大提高。实验中,该克隆表达的重组蛋白产量可观、可溶性较好,并且能够通过亲和层析、凝胶排阻层析和离子交换色谱等方法纯化。我们最终获得纯度良好且稳定性高的LIM(LHX2)-LID(LDB1)蛋白,并可进行下一步晶体的筛选工作。
LIM结构域家族以其在胚胎发育及肿瘤中的重要作用,近年来越来越多的为研究者所关注,本论文的工作为后续晶体结构解析以及LIM结构域的功能研究发提供了必要依据。