三角帆蚌高致病力菌株的分离鉴定及其对宿主免疫应答的影响

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三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我国主要的淡水珍珠贝类,具有重要的生态价值和经济价值。近年来,我国已成为世界上最大的淡水珍珠生产国,平均年产量超过1000 t,占全球产量的98%以上。然而,随着水环境的污染和集约化养殖程度的提高,三角帆蚌的病害问题日渐突出,严重制约着其养殖业和珍珠产业的可持续发展。本论文针对重庆市贝类养殖试验基地爆发的细菌性疾病,主要开展病原生物学、免疫学、病理学和致病机制等方面的研究,以期为三角帆蚌频发的细菌性疾病提供科学的防治依据。本论文采用的主要方法和得到的主要结果如下:(1)为探究常见致病菌感染对三角帆蚌免疫应激的影响,测定了经嗜水气单胞菌、无乳链球菌和荧光假单胞菌感染后不同时间点(hours post infection,hpi)血淋巴的免疫酶活性、血细胞总数和类型的变化。结果显示,除荧光假单胞菌组的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶外,其余各酶活性均在24 hpi急剧下降或保持不变。然而,三个试验组的过氧化物酶活性在24和48 hpi均显著升高(P<0.05),随后呈时间依赖性抑制趋势。溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶活性先下降,在96 hpi逐渐恢复至对照水平。在本试验中,三角帆蚌的血细胞分为5种类型,以颗粒细胞和透明细胞为主。细菌感染诱导血细胞总数增加,尤其是各试验组的颗粒细胞比例分别增加了18.44%、15.05%和8.38%,这表明颗粒细胞是执行细菌性抗原吞噬功能的重要免疫响应细胞。(2)为有效掌握自然发病三角帆蚌中病原菌的组成分布及基本特性,本试验采用传统的病原菌分离培养方法,从病蚌中分离致病菌并开展了相关生物学特性研究。结果显示,从濒死的三角帆蚌中共分离得到14株菌株,其中血淋巴和组织中致病力最高的菌株HOP3和GL1感染后的致死率分别可达84.8%和97%。大多数菌株感染导致了三角帆蚌的显著死亡率(P<0.05),但不同菌株的致病力相差较大,感染7 d后蚌的存活率在3%-88%之间。通过形态学观察、生理生化特征和16S r DNA基因序列分析,确定这两株菌分别为嗜麦芽窄食单胞菌和维氏气单胞菌。两株菌均具有溶血性,能产生蛋白酶和淀粉酶。另外,两株菌的生长特性研究表明,它们均能在较宽广的温度、p H和盐度范围内存活,而菌株GL1的环境适应性更强。药敏试验结果表明菌株HOP3具有多重耐药性。(3)本试验进一步通过嗜麦芽窄食单胞菌HOP3和维氏气单胞菌GL1对三角帆蚌的侵染试验,探究两株菌对三角帆蚌先天免疫应答的影响和组织侵袭情况。菌株HOP3和GL1对三角帆蚌7 d的LD50分别为2.45×10~6 CFU/g和2.24×10~5CFU/g。3、6、12、24和48 hpi测定试验蚌的血淋巴、鳃和肝胰腺中的免疫酶活性。结果显示,感染菌株HOP3和GL1后,三角帆蚌体内的酶活均有不同变化,且被感染后一定时间内SOD、谷胱甘肽S-转移酶、过氧化氢酶、还原型谷胱甘肽和总抗氧化能力均可达到峰值,LZM仅在鳃中变化显著。两试验组中酶活性变化趋势相似,表明两株细菌感染可诱导三角帆蚌急性免疫应答,并引起氧化应激,感染严重时可造成组织损伤甚至个体死亡。48 hpi对试验蚌的不同组织进行病理切片观察,结果显示,试验蚌的闭壳肌、鳃、肝胰腺和外套膜受损较为严重,而斧足相较于上述4个部位未有明显病变。(4)为探究三角帆蚌响应维氏气单胞菌GL1感染的免疫应答机制,对感染菌株GL1的肝胰腺组织进行转录组学分析。高通量测序数据经组装共得到Contig659192条、Transcript 467244条和Unigene 245638条。差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)统计发现,GL1感染组三角帆蚌的肝胰腺共有5957个DEGs,其中上调DEGs有3885个,下调DEGs有2072个。进一步分析表明,这些DEGs主要富集于细胞凋亡通路、吞噬小体通路、溶酶体通路、核糖体和白细胞跨内皮迁移、人类癌症和焦点粘连等免疫相关通路。随后随机挑选7个DEGs进行实时荧光定量PCR(RT-q PCR)验证,发现RT-q PCR结果与转录组测序结果的表达趋势一致,从而表明了测序结果的可靠性。最后,利用RT-q PCR对免疫相关基因(Hc IL-17、IAP、Gal R2、Hc GST、s HSPs和TR)的表达模式进行了研究。结果表明,感染GL1能够有效刺激三角帆蚌免疫相关基因的相对表达,且在12 hpi的相对表达水平与转录组测序的变化基本一致,同时其相对表达水平具有组织差异性。综上所述,本论文确定此次三角帆蚌发病的病原为多种细菌,且以维氏气单胞菌为主。嗜麦芽窄食单胞菌HOP3和维氏气单胞菌GL1对三角帆蚌的先天免疫组织和系统均有较强破坏,对其养殖业的发展极具威胁,在防治过程中可考虑多西环素和米诺环素。本论文筛选鉴定了三角帆蚌与细菌感染相关的免疫功能基因,为揭示细菌的致病机理和进一步的免疫通路相关研究提供了重要参考。
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