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肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是一种胞外菌,革兰阳性,定植于人上呼吸道黏膜中。这种无症状定植在宿主免疫状态低下和强毒血清型感染时,可能发展为侵袭性疾病,如社区获得性肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎等。炎症小体（inflammasome）是一种多蛋白复合物,由受体蛋白、衔接蛋白和效应蛋白组成。炎症小体的受体蛋白大都属于NLRs家族和ALRs家族,根据受体蛋白组成的不同,研究较多的是NLRP3、NLRP1、NLRP6和AIM2炎症小体,NLRP2、NLRP7、NLRP12等炎症小体也有报道。PRRs识别PAMPs后借助衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白ASC来募集和激活半胱天冬酶1前体（pro-caspase-1）和/或半胱天冬酶11前体（pro-caspase-11）.效应蛋白,并使caspase-1和/或caspase-11的前体切割为成熟形式并发挥作用,进而调控细胞程序性死亡即细胞焦亡（pyroptosis）以及细胞因子IL-1β和IL-18的成熟与分泌。最新研究表明,gasdermin D（GSDMD）也是半胱天冬酶的靶标之一,GSDMD裂解后作用于胞膜形成gasdermin孔,最终导致膜的破裂并参与到细胞焦亡的过程中。本实验团队前期研究报道:当巨噬细胞被肺炎链球菌感染时,会导致AIM2、NLRP3炎症小体的激活,caspase-1水解为活化形式切割pro-IL-1β,ASC、NLRP3、AIM2缺失会导致宿主免疫肺炎链球菌的能力减弱。但在宿主防御病原微生物侵害进程中,NLRP6炎症小体所扮演的角色尚不清楚,并且肺炎链球菌感染PECs过程中NLRP6炎症小体激活的具体机制也有待更深入的研究。本试验以野生型小鼠（WT）与NLRP6敲除小鼠(NLRP6-/-)为研究对象,通过体内外感染肺炎链球菌试验,对肺炎链球菌诱导NLRP6炎症小体激活的机制及NLRP6在SP感染防御中的作用进行探索。1.肺炎链球菌感染中NLRP6炎症小体激活并参与下游IL-1β成熟与分泌研究用肺炎链球菌感染野生型小鼠的PECs,NLRP6 m RNA的表达情况通过RT-PCR检测,显示肺炎链球菌感染后NLRP6的表达水平上升。再用肺炎链球菌分别感染WT、NLRP6-/-小鼠PECs,通过ELISA检测细胞因子分泌的水平,用q PCR检测IL-1βm RNA的表达情况,Western blot检测caspase-1、IL-1β、GSDMD、caspase-11的前体形式以及成熟形式蛋白表达水平,并用化学交联方法处理后检测ASC的寡聚化情况。发现在感染肺炎链球菌后,NLRP6-/-巨噬细胞中的IL-1β分泌水平明显降低,但IL-1β的表达水平与WT巨噬细胞相比并没有差异,敲除NLRP6的巨噬细胞中caspase-1、caspase-11、GSDMD的成熟形式均降低,ASC的寡聚化形式也显著减少。以上结果说明,当肺炎链球菌感染PECs时,会引起NLRP6炎症小体的激活组装,并且NLRP6参与IL-1β的成熟与分泌,但并不参与IL-1β的表达水平,同时NLRP6炎症小体的激活不仅会募集caspase-1也会引起caspase-11的切割。2.NLRP6在肺炎链球菌感染巨噬细胞时对信号通路作用的研究用肺炎链球菌D39分别感染NLRP6-/-、WT小鼠的腹腔巨噬细胞,Western blot检测在0、15、30、60、120 min时间点p-p65、p-ERK1/2和p-IκBα蛋白表达水平以及总蛋白的表达量。结果显示,30 min后相较于野生型小鼠,NLRP6敲除小鼠腹腔巨噬细胞中p-p65、p-ERK1/2和p-IκBα表达水平明显升高。该结果表明,NLRP6可以抑制肺炎链球菌感染巨噬细胞中的NF-κB和ERK信号通路的磷酸化。3.NLRP6在肺炎链球菌感染防御中的作用研究用肺炎链球菌D39滴鼻感染WT及NLRP6-/-小鼠,对感染后生存情况进行统计。小鼠感染D39 48 h后进行肺匀浆、梯度涂板,检测肺脏细菌定殖量;摘取肺脏组织进行HE染色,切片观察肺炎症病理变化。为研究在宿主感染肺炎链球菌后,NLRP6缺失对机体细胞因子分泌水平的影响,在两种小鼠感染D39 12 h后取肺泡灌洗液,ELISA检测其中细胞因子分泌水平的差异。为了解NLRP6在宿主抗肺炎链球菌中的角色,取两种小鼠的肺脏组织进行转录组测序分析,找出差异基因,以及运用流式细胞检测手段,探究NLRP6损害宿主的机制。结果显示:感染14 d之后与WT小鼠相比,NLRP6-/-小鼠的死亡率（46.7%,7/15）更低,而WT小鼠的死亡率为76.5%（13/17）;WT小鼠肺脏细菌定殖量为NLRP6-/-小鼠的10倍,两组肺脏中的细菌定殖量差异显著;与NLRP6-/-小鼠相比,WT小鼠肺部炎症反应加重,表现为更为明显的间质增生、炎性细胞浸润等;NLRP6-/-小鼠BALF中IL-1β的分泌量显著低于WT小鼠,而TNF-α的分泌量无显著性差异。转录组测序结果显示,NLRP6敲除后,与中性粒细胞的迁移以及表达相关的基因明显升高,RT-PCR进行差异表达基因的验证。同时流式细胞检测发现,NLRP6敲除后会增加巨噬细胞与中性粒细胞的募集。以上结果显示:NLRP6可以负调控宿主抗肺炎链球菌感染,导致机体表现为更低的死亡率、细菌定殖量以及更轻微的肺部炎症情况。而在肺炎链球菌感染过程中,NLRP6损害宿主的功能可能是由于抑制中性粒细胞与巨噬细胞的表达与迁移。