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目的:前期研究发现丹红化瘀口服液(Danhong Huayu Koufuye,DHK)显著抑制深静脉血栓(deep vein thrombosis,DVT)形成。本课题首先对狭窄法诱导大鼠DVT模型进行优化,并进一步从血液循环系统及Sirtuin 1(SIRT1)调节的炎症反应探讨DHK干预DVT形成的机制。方法:一、筛选最佳造模条件:180-340 g SD大鼠,雌雄兼用,丝线或聚丙烯线狭窄下腔静脉诱导DVT形成,结扎或不结扎下腔静脉侧支,造模1 d后测量栓重,苏木素-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色法行组织病理学观察及炎性细胞计数,免疫荧光法定位中性粒细胞,并建立栓重的多重线性回归模型,综合探索狭窄法诱导大鼠DVT形成的最佳条件。二、考察DHK抗栓作用:大鼠按体重随机分为假手术组、模型组和DHK(3.2 mL/kg/d)组。狭窄法诱导大鼠DVT,采用1种预防给药和3种治疗给药的模式,通过检测栓重和观察组织病理学变化,评价DHK抗栓作用。三、探索DHK抗栓机制:大鼠按体重随机分为假手术组、模型组、DHK低、中、高剂量组(1.6、3.2和6.4 mL/kg/d)、肝素组、氯吡格雷组和白藜芦醇组。狭窄法诱导大鼠DVT,氯吡格雷组大鼠于术前2 h和术后24 h灌胃给药,其余组别大鼠于术后1h和24h给予相应受试物,所有大鼠末次给药1.5h后取材。检测栓重、凝血功能、纤溶系统功能、全血粘度、血细胞数量和血小板聚集率,从血液循环系统探讨DHK干预DVT形成的机制。此外,HE染色行组织病理学观察及炎性细胞计数,ELISA法检测血清TNF-α及IL-1β水平,qRT-PCR法检测静脉壁(含血栓)SIRT1 mRNA表达,免疫荧光法检测静脉壁(含血栓)SIRT1和组织因子(tissue factor,TF)蛋白表达,Western blot 法检测静脉壁(含血栓)SIRT1、p-p65、乙酰化 p65(acetylated-p65,Ace-p65)、p65及TF蛋白表达;再将SIRT1抑制剂(EX527)和DHK联合用药,检测栓重、静脉壁(含血栓)的SIRT1、Ace-p65及p65蛋白表达,基于SIRT1/NF-κB探讨DHK干预DVT形成的机制。结果:一、筛选最佳造模条件:丝线组和聚丙烯线组栓重、静脉壁及血栓中的炎性细胞数量无统计学差异。220-340g大鼠比180-220g大鼠形成的血栓更重。雄鼠比雌鼠形成的血栓更重,当大鼠体重为180-260 g时,雄鼠与雌鼠形成的血栓栓重无差异,但是当体重为260-300g时,雄鼠比雌鼠形成的血栓更重。当雌鼠体重处于180-220 g时,侧支距离大于1.0cm 比侧支距离小于或等于1.0cm形成的血栓更重,此时结扎侧支可以使栓重显著增加;220-300 g雌性与180-300g雄性大鼠的倾支距离和侧支结扎对大鼠的栓重无影响。从体重的多元线性回归模型可见,性别和体重是影响DVT的关键因素。二、考察DHK抗栓作用:造模60 min时,模型组静脉腔可见少量血丝,静脉壁有少量炎性细胞渗出;造模1d、3d和7d时,模型组有大量血栓形成,静脉壁和血栓中有大量炎性细胞。同模型组相比,造模60 min时,DHK组(预防性给药)静脉壁炎性细胞渗出显著减少;造模1d、3d和7 d时,DHK组(治疗性给药)栓重分别相应降低37%、37%和44%,且静脉壁和血栓中炎性细胞数量显著减少。三、探索DHK抗栓机制:同模型组大鼠比,DHK对凝血四项、血浆组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,tPA)及纤溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor,PAI-1)水平、血细胞数量、全血粘度和二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)诱导的血小板最大聚集率无影响。DHK组大鼠静脉壁(含血栓)SIRT1 mRNA及蛋白表达显著增加,血栓及静脉壁炎性细胞数量、血清TNF-α及IL-1β水平、静脉壁(含血栓)p-p65、Ace-p65和TF蛋白表达均显著降低。同DHK组大鼠相比,DHK+EX527组大鼠的栓重、静脉壁(含血栓)Ace-p65蛋白表达均显著增加,SIRT1蛋白表达显著降低。结论:本实验条件下,体重为220-260 g的雌雄大鼠更适合建立下腔静脉狭窄法(不结扎侧支)诱导DVT模型,而且建议采用丝线进行下腔静脉的狭窄操作。基于此模型,我们发现DHK能预防DVT形成,也能治疗DVT,对DVT早期和后期均有抑制作用。DHK抑制早期DVT的机制是上调SIRT1缓解炎症反应。