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目的近年来碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae CRKP）检出不断增加成为儿童健康及生命的巨大威胁和挑战,本研究旨在了解2016年-2017年上海市儿童医院CRKP菌株的检出情况,确定产碳青霉烯酶菌株和科室分布情况,明确产不同碳青霉烯酶菌株的药物敏感性,判断医院内是否存在暴发流行情况,结合患儿临床资料分析CRKP感染的临床特点;选取造成暴发流行的新出现碳青霉烯酶基因进行深入研究,了解该基因在其它肠杆菌科细菌中是否存在,分析其耐药性及可能的传播途径,并通过测序分析质粒结构及基因周围环境,本研究共包含两部分内容:第一部分上海市儿童医院CRKP耐药特征及流行病学分析方法选取上海市儿童医院2016-2017年临床分离的170株CRKP,采用微量肉汤稀释法检测药物敏感性确定其最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration,MIC）,MAST D73C纸片组合检测碳青霉烯酶型并用PCR方法进行确认,多序列位点分型（Multilocus sequence typing,MLST）和脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis,PFGE）分析菌株同源性,同时收集临床资料。结果170株CRKP中,blaOXA-232基因检出最多,检出率为42.35%,其次分别为blaNDM-1（20.59%）、bla KPC-2（17.65%）、blaNDM-5（16.47%）和blaIMP-4（1.18%）。MAST D73C纸片组合区分KPC、MβL、OXA-48酶的灵敏度分别为36.67%、100%、81.94%,特异度分别为100%、93.58%、96.43%。170株CRKP均对碳青霉烯类和头孢菌素类表现出高耐药性（>95%）,仍对替加环素和多粘菌素保持敏感,各碳青霉烯酶型菌株间呈现出不同的耐药特征。MLST分型共获得16种ST型别,最常见的是ST15（41.76%;71/170）,其次是ST48（17.65%;30/170）和ST11（17.65%;30/170）。PFGE结合MLST分型结果显示医院存在多次不同基因型菌株的克隆播散。此外,其它β-内酰胺酶基因blaTEM、blaCTX-M和DHA-1在本研究中也有检出。临床资料分析显示,65.88%的病人发生CRKP感染（112/170）,主要是下呼吸道（51.78%;58/112）和血流感染（18.75%;21/112）。大部分患儿在CRKP菌株分离之前曾接受过抗生素的治疗,尤其是碳青霉烯类（76/170）和β-内酰胺类及其酶抑制剂（91/170）。第二部分bla NDM-5基因在肠杆菌科细菌中的传播机制方法收集上海市儿童医院2017年1月至3月临床分离的146株碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae,CRE),采用PCR方法扩增常见的碳青霉烯酶基因(blaKPC,bla NDM,bla IMP,bla OXA-48和blaVIM),选择bla NDM-5基因阳性的菌株进行后续实验。微量肉汤稀释法检测对常见抗菌药物的MIC值。MLST和PFGE分析菌株同源性。采用PCR为基础的质粒分型方法（PCR-based replicon typing,PBRT）进行质粒分型。选取4株菌进行后续实验,限制性内切酶片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism,RFLP）分析不同菌株中NDM-5质粒的序列差异,肉汤连续传代法分析NDM-5质粒稳定性。S1-PFGE确认菌株携带质粒情况,随后采用southern-blot明确携带blaNDM-5基因的质粒大小。质粒测序分析NDM-5质粒结构及不同质粒中blaNDM-5基因周围环境。结果146株CRE中,共有22株经PCR证实携带blaNDM-5基因,包括16株肺炎克雷伯菌,4株产气克雷伯菌和2株大肠埃希菌。所有的菌株对β-内酰胺类及抑制剂耐药,对替加环素、多粘菌素E、多粘菌素B敏感。PFGE和MLST结果显示,16株肺炎克雷伯菌具有相同的PFGE条带,均属于ST48型,4株产气克雷伯菌具有相同的PFGE条带,2株大肠杆菌（ST617和ST1236）的PFGE图谱不同。RFLP结果显示,4株菌经Eco RI酶切后电泳显示条带相同,而经Hind III酶切后,菌株Z244与其它3株菌条带稍有不同。质粒稳定性试验结果显示,连续传代100次后,bla NDM-5质粒仍稳定存在于临床菌株中。S1-PFGE和southern-blot结果显示,blaNDM-5基因均位于46Kb左右大小的质粒上。经质粒测序,p NDM-K725、p NDM-CR33、p NDM-Z214和p NDM-Z244的质粒大小分别为43125bp、43252bp、43252bp和46047bp,均属于Inc X3型别。基因组比较发现p NDM-K725,p NDM-CR33和p NDM-Z214三个质粒基因组结构和序列基本相同,但是与p NDM-Z244稍有不同,blaNDM-5基因上游存在ISAba125及部分IS3000碱基序列的缺失。论综上,通过对本医院内分离的CRKP菌株的流行病学监测,发现blaOXA-232和bla NDM-5基因是首次从患儿中检出,并在医院NICU病房内引起了暴发流行,所有CRKP菌株对头孢菌素类及碳青霉烯类药物呈高度耐药,基本对替加环素和多粘菌素保持敏感,且不同碳青霉烯酶型耐药谱存在差异,这些结果为临床治疗CRKP引起的重症感染、制定科学有效的预防和控制措施提供了重要的实验依据。进一步对blaNDM-5基因的研究发现除肺炎克雷伯菌外,blaNDM-5基因在大肠埃希菌和产气克雷伯菌中也有检出,明确携带blaNDM-5基因的Inc X3型质粒是造成此次播散的主要原因,并且除p NDM-Z244外,其它质粒中blaNDM-5基因上游存在ISAba125及部分IS3000碱基序列的缺失,与常见质粒p NDM-MRG194中的结构不同,推测是由于blaNDM-5基因在转移过程中发生了ISAba125转座酶的丢失,提示ISAba125对blaNDM-5基因的水平转移并非是必要的。这是首次发现blaNDM-5基因在肺炎克雷伯菌、产气克雷伯菌和大肠埃希菌中同时发生暴发流行,blaNDM-5基因介导的高耐药性和Inc X3质粒的易传播性应引起临床和感控部门的足够重视,加强对CRKP的流行病学监测,警惕其流行变迁和耐药谱的改变。